用于FLUOVIEW FV4000激光共焦扫描共聚焦显微镜的新一代SilVIR探测器系统

摘要

Evident率先为FV4000激光共焦扫描共聚焦显微镜推出了专有的新一代SilVIR探测器系统。该探测器在多色成像领域树立了新的基准，在可见光到近红外波长范围内噪波噪声很少小、灵敏度非常高，信噪比(S/N)令人赞叹。SilVIR探测器能够准确探测光子，包括高速和高动态范围光子计数，有助于确保实验的可重复性。此外，它还避免了PMT探测器通常需要进行的复杂增益调整，从而简化了操作体验。SilVIR探测器的上佳性能使其有望成为行业激光扫描显微术领域的新标准。
 

1. 简介

光电倍增管(PMT)能以高灵敏度和高增益检测多个光子水平的微弱光，一直是激光扫描显微术(LSM)领域捕获采集很微弱的荧光的标准探测器。尽管如此，采用PMT的LSM也存在诸多问题，下文将对此展开讨论。

SilVIR探测器系统使用半导体型传感器来探测荧光。这种硅光电倍增管(SiPM)可以避免传统PMT的许多问题和限制。信号处理电路还采用了可最大限度发挥传感器能力的技术，从而扩展了其在高像素数和高速成像领域的适用范围（图1）。

在本文中，我们会介绍与使用PMT探测器的传统LSM成像有关的问题，并说明SilVIR探测器如何解决这些问题。

_{图1. 组成SilVIR探测器的装置：(a) FV4000荧光探测器；(b) 显示SilVIR探测器光谱灵敏度的图表——在400 nm到900 nm波长范围内，使用宽带型和红移型时，探测器的灵敏度高于传统的高灵敏度GaAsP-PMT；(c) SilVIR探测器由SiPM传感器、1 GHz A/D采样和数字信号处理组成。}
 

2. 激光扫描显微镜工作者的需求——打造更优质的探测器

LSM用户的常见不满包括：

• 对该调整哪些设置才能尽可能地发挥设备性能感到困惑。
• 过度的光漂白和光毒性。
• 探测器的意外饱和。
• 对提高图像质量、分辨率和帧率的需求。
• 无法采集更优质的图像。

这些不满的根源在于PMT探测器及其主要操作方法。下面，我们将阐述我们在着手设计更优质的探测器时所考虑的一些因素。

高灵敏度和信噪比(S/N)

为了高效地探测哪怕是少量的入射光子——这是对微弱荧光信号成像的要求——探测器必须具有高量子效率(QE)和光电探测效率(PDE)。此外，传感器和探测器电路的固有噪波噪声必须达到可以忽略不计的程度，以实现高信噪比。

探测到的光的定量

虽然对探测到的光的物理测量有各种各样的定义，但“光子数”的定量是对很微弱的荧光进行定量的较准确和通用方法。因此，测量强度的较简单方法是测量探测到的光子数（图2）。

用通用数值来定量荧光强度非常重要。例如，这可以实现在不同仪器上再现相同的成像结果，因为它并非设备专用数值。此外，由于光子数值是通用的，研究人员可以更方便地相互共享数据。最后，定量值可作为分析过程中预处理图像的指标使用。

_{图2. 当光子入射到光敏传感器表面时，荧光探测过程就会开始。然后，探测到的光子将转换成电子，并在放大后以电流形式输出。电流通过放大电路后接受模数转换。然后，数字化信号通过算术处理转换成对应每个像素的强度值，并通过软件显示为图像中的每个像素。}

高动态范围

即使可以实现以上各项，如果在给定时间内可探测到的最大光子数（称为动态范围）较小，那么在荧光强度较高的区域就会出现强度饱和，从而失去定量性。此外，提高图像质量的一种方法是通过增加激发光激发出较多的具有强激发的发射光子来抑制光子噪波噪声（传感器上光子探测的概率性噪波噪声，也称为射击散粒噪波声）。当动态范围较高时，可以在亮度不饱和的情况下捕获采集高质量的图像。例如，如图3所示，右侧的较强激发探测到的荧光越多，图像质量就越好。但探测器的饱和最终会损害许多后处理和分析步骤。

一致的图像定量探测器增益确保图像可定量

理想的情况是在不改变探测器或电路条件的情况下获得高动态范围。例如，如果改变探测器增益以扩大上限范围，所产生的图像强度也会随之改变。但这种关系并不是线性的，因此难以只根据获得的图像来反向估计探测到的光量。必须单独制作校准曲线进行校正。另一方面，图3中的线图显示了每幅图像上A线的亮度轮廓。使用固定固定的探测器设置获得这些值时，可以根据任何图像的强度来定量估算每个像素探测到的光子数量。

_{图3. 荧光强度与画质之间的关系。信噪比取决于荧光强度/√荧光强度。}
 

3. LSM成像中的传统PMT探测器问题

下面，我们将阐述使用PMT探测器进行激光扫描显微镜检查时存在的主要问题。

难以同时实现高灵敏度和高信噪比

目前，通常使用GaAsP光电阴极型PMT [1]作为高灵敏度探测器，其在可见光范围内的QE已提高到40%或更高。由于传感器和电路会产生噪波声，因此一般使用较高增益放大信号来防止相对噪波噪声影响图像。PMT还会在受光表面将光子转化为电子，然后经过随机、多步骤的放大过程产生电流信号（图4）。因此，即使探测到的光子数量恒定，每一次的输出也会因随机波动而发生变化。这可能会降低图像的信噪比，尤其是对于在探测到的光子较少的高像素高速成像的场景。

_{图4.PMT输入-输出特性的结构。当光子入射到光电阴极时，光电阴极发射出的电子在真空管中被放大。由于次级电子在多个打拿极之间链被反复放大，因此探测一个光子时输出的脉冲信号并不均匀或稳定。}

探测到的光子强度的定量性低

如上所述，PMT在光电子放大过程中会出现随机变化。因此，输入/输出定量性较低，尤其是当光子探测率较低时。此外，虽然可以通过改变电极间施加的电压来调节增益，但相应的输入输出比也会发生变化。 即使施加相同的电压，每个PMT的实际增益也会因个体差异而有很大不同。 如果将外加电压设定在较低水平以放大大量光子，则会降低线性度[1]。

加之，以下不可避免的现象会导致PMT的灵敏度随着长期使用并和因使用而累积的探测到的光子数增多而衰减而降低。

• 当光子进入光电阴极时，由于外部光电效应，电子从光电阴极发射到真空管中。由于电子无法得到充分补充，光电阴极会发生退化衰减。
• 与光电阴极发射的电子（光电子）发生碰撞而导致的打拿极退化衰减。
• 与光电子和真空管中的残留气体或杂质碰撞所产生的离子发生碰撞而导致的光电阴极或打拿极退化衰减。
• 光电子与打拿极碰撞而使打拿极产生杂质所导致的真空度下降。

由于上述现象，使用PMT的LSM无法提供探测到的光量与图像强度之间的定量关系。

难以同时实现高动态范围和高信噪比

当传感器增益增加时，尽管存在噪波噪声，仍能检测到几个光子的微弱信号，从而实现高信噪比。但PMT输出电流的上限低到只有几μA。如果增益设置得高，即使探测光子数量很少，输出也容易饱和，从而导致动态范围小（图5a）。另一方面，如果增益低，即使探测到强荧光（大量光子），输出信号也不会饱和，动态范围就会更大。但弱荧光（如几个光子）不会被放大，而是会被埋没在噪波声中，导致信噪比下降（图5b）。因此，用户需要根据对象的亮度和所需的画质水平手动调节探测器的增益。此外，还有一个缺点是，动态范围和信噪比会无意中因这种调节而发生变化。

_{图5.调节PMT的增益需要平衡信噪比和动态范围；(a) 高增益——当探测到一个光子时，输出信号可以放大到高于噪波声，但动态范围会因此减小，而且容易饱和；(b) 低增益——当探测到几个光子时，输出信号无法与噪波声区分开来。另一方面，动态范围较高，并且探测到大量光子时不会饱和。}

复杂的探测器设置

在调节探测器设置，以在使之获得令人满意的画质的同时避免亮度饱和的过程是非常复杂的，对于未熟练掌握LSM的用户来说，这很困难。为了说明问题，图6显示了探测器增益设置不同导致荧光强度不同的荧光珠小球。

图6a显示了在不同激发下以高增益采集的荧光珠小球。即使采用弱激发，暗荧光珠小球也几乎无法与噪波声区分开来（图中最左侧的图像），但当激发光增加时，亮荧光珠小球就又会饱和（图中右侧的两个亮荧光珠小球部分）。

另一方面，图6b显示了使用较低增益采集的相同荧光珠小球图像。在弱激发下，暗荧光珠小球（图中左侧的两颗）的信号被完全埋没在噪波声中。与高增益相比，其优势在于即使将激发调到最高水平（图中最右侧），亮珠荧光小球也不会饱和，但当关注点是暗珠荧光小球的信噪比时，其信噪比并不优于图6a最右侧的图像（使用高增益捕获采集的图像）。

细胞标本的典型荧光图像在不同区域的亮度差异很大，而延时或Z堆栈图像在整个堆栈中的亮度差异可能更大。即使是经验丰富的用户也难以找到非常合适的探测器设置，能够在暗区获得信噪比令人满意的图像，而又不使亮区饱和。许多用户会对探测器增益、激发光强度、曝光持续时间等参数进行试错调节，这会导致显微镜工作者采集到许多失败的图像。

当探测器的设置不会导致饱和，从而导致信噪比不足时，就可以通过捕获采集多帧图像并对其进行平均或累加来抑制随机噪声，从而提高信噪比。 在这种情况下，需要捕捉许多帧，这又会导致实际成像帧率大幅下降。

如上所述，使用PMT的传统LSM需要调整复杂的成像参数，如探测器增益、激发光强度和曝光持续时间，以及帧间平均次数。

_{图6.调节PMT的增益需要平衡信噪比和动态范围，这比较困难。因为这些图像是使用不同的激发激光设置采集的，右侧的图像是使用较高的设置采集的。图像下方的图显示了沿A线的强度分布。信噪比是指S（轮廓高度）与N（光子噪波声）和Nd（电路噪波噪声）的比率。图6a显示的是使用高增益采集的样本。暗淡珠荧光小球具有较高的信噪比，但较亮的珠小球会出现饱和。图6b显示的是使用低增益采集的样本。暗淡珠荧光小球具有较低的信噪比，但亮珠小球不会出现饱和。}

探测电路问题因素

探测电路以及传感器也存在问题。由于传感器信号及其放大电路存在噪波声，因此当模数(AD)转换器采样的原始信号作为像素数据接受处理时，信噪比会变得非常低（图7a左侧）。一般来说，在模拟探测电路中使用低通滤波器或积分器对信号进行平滑处理后再进行采样，可将此信噪比提高到与荧光强度的真实值相当（图7a右侧）。但扫描速度越快（如共振扫描振镜），穿越扫描样本结构所需的时间就越短。图7b显示的是与图7a所示结构相同的荧光图像，不同的是其扫描速度是图7a的两倍。如果以同样的方式应用低通滤波器进行降噪，则无法获得足够的时间分辨率来分辨具有高空间频率的精细结构，从而降低所生成图像的空间分辨率（图7b右侧）。

当提高低通滤波器的截止频率时，时间分辨率就会提高。但噪波声抑制效果会下降，信噪比也会变差。为了避免信噪比下降，即使提高低通滤波器的截止频率，也必须将模数转换器的采样率从像素时钟的几倍提高到几十倍，以便在一个像素内进行大量采样（过采样）。此外，更快的扫描速度和更高的像素数缩短了一个像素的停留时间，这就是为什么需要更快的模数转换器采样速度。

对于噪波声平滑，另一个问题是模拟电路只能采用简单滤波器（如低通滤波器），以牺牲时间分辨率为代价。可取的做法是，采用通过对高速采样的数据应用高级数字信号处理滤波器，只分离噪波声而不牺牲时间分辨率的滤波方法。

_{图7.减少噪波声对画质和空间分辨率的影响。图7a是以标准扫描速度捕获采集的，通过减少噪波声，画质得到了改善。图7b是以比7(a)快两倍的扫描速度捕获采集的，可以看到空间分辨率因信号带宽下降而降低。}

我们的SilVIR探测器结合了新型半导体型SiPM传感器和高速数字采样技术，可以解决上述由PMT引起的LSM成像问题。在下一小节中，我们将说明我们如何利用自身的先进技术解决上述问题。
 

4. SilVIR探测器技术简介

4-1.SiPM的特性

作为SilVIR探测器核心的SiPM传感器是一种半导体传感器，由数千个盖革模式雪崩光电二极管(APD)或单光子计数雪崩光电二极管（简称SPAD）组成的二维阵列构成。探测到的信号以所有APD总和的形式输出[2]（图8）。

盖革模式凭借高度稳定的倍增过程，即使增益很高，也仍可在高信号电平下探测到单光子入射。此外，半导体制造工艺可以精确控制SiPM的个体差异。通过可靠稳定的批量生产，可显著减少SiPM之间的光电检测效率(PDE)和增益差异。此外，即使有许多光子同时入射，SiPM也会输出这些光子在各自APD产生的电流的总和，因此输出电流的上限很高，从而可以在宽动态范围内探测大量入射光子。换言之，单光子信号可通过高增益倍增，多像素APD阵列获得宽探测范围。这样就可以同时实现高信噪比和宽动态范围，无需通过调整增益在两者之间折衷。

此外，SiPM的光电转换与光电二极管类似，都是利用电子从价带被激发到导体的内部光电效应。因此，电子被激发后会迅速得到补充。结果就是，即使入射光量很大，灵敏度和增益也不会降低衰减。

_{图8.硅光电倍增管(SiPM)传感器的结构及其输入输出特性。图8(a)显示，SiPM由多像素APD组成。当一个光子入射到APD的光子接收表面时，通过内部光电转换输出电流信号，然后在雪崩层进行雪崩电子放大。图8(b)显示，当多个光子同时入射时，输出信号是APD信号的总和。APD在探测到光子时的反应输出波形恒定且稳定。}

此外，SiPM传感器还具有上佳的灵敏度特性。图1b显示了SiPM传感器的光谱灵敏度。使用具有不同光谱灵敏度的SiPM传感器组合，即所谓的宽带硅探测器(BSD)和红移硅探测器(RSD)，在可见光(400 nm)至近红外(900 nm)波长范围内，您可以实现比GaAsP-PMT探测器更高的灵敏度。SiPM的光子探测效率(PDE)由以下等式定义：

PDE = QE × FF × AP

QE：量子效率
FF：孔径效率（填充因子）
AP：盖革模式概率（雪崩概率）

FF取决于SiPM光子接收表面上APD的面积与APD像素间死区面积之比。AP取决于施加到SiPM上的电压——电压越高，所能实现的PDE就越高。另一方面，增加施加的电压会提高传感器的噪波声。例如，在Hamamatsu Photonics制造的S13360-3050型号中，通过将过压（所施加的高于击穿电压的电压）从3 V增加到7 V，可将PDE提高约1.4倍，但暗计数噪波声会增加约2倍，串扰噪波声会增加2倍以上，脉冲后噪波声会增加3倍以上[2]。增加的噪波声会抵消PDE提高所带来的益处，因此无法改善信噪比。此外，噪波声的增加会严重干扰光子探测的定量性，而这却是SiPM的主要优势之一。而且，由于增益也增加了两倍或更多，会使探测动态范围缩小。仅关注高PDE或QE值的潜在隐患的说明，性示例提醒我们要避免盲目追求此类特性，因为它们可能会导致意想不到的弊端。因此，FV4000共焦显微镜使用具有较佳过电压的SiPM，以获得均衡的噪波声水平和灵敏度，以及卓越的荧光探测动态范围。

与PMT相比，SiPM的暗计数噪波声较高，这常被视为一个缺点。作为一种对策，光子接收表面将冷却制冷到大约-20 °C，从而将暗计数噪波声降低到每秒几千计数到几万计数范围。但这仍然大于冷却制冷后的PMT。然而，当使用暗计数噪波噪声为每秒1万计数的SiPM以512像素/行、2 µs/像素停留时间进行扫描时，相当于1个光子的暗计数噪波声只会出现在每1行的约10个像素中。这个数量对LSM画质的影响很小。

使用SiPM作为LSM探测器的另一个缺点是，输出信号中可能会残留长尾衰减（图8）。这会给高速成像带来问题，但正如下一小节所述，我们通过实施创新的探测电路解决方案，成功地解决了这一问题。

4-2.高速采样和数字处理特性

如上所述，传统系统通过将使用模拟电路滤波进行的信号平滑与像素分辨率所需的最小模数采样频率（采样周期约为像素周期的1/2）相结合，平衡信噪比和时间分辨率。但这种解决方案在技术上有局限性，无法应对高速共振扫描振镜的较高像素数（较短像素周期）（图9a）。

高速模数采样

我们实现了高达传统采样率12倍的1 GHz模数采样率，并采用了在一个像素周期内执行大量采样的过采样方法。由于SiPM传感器的输出具有宽动态范围，因此其输出信号的范围与PMT相比也非常大。在模数采样率提高的同时，振幅分辨精度也达到传统装置的16倍（精度从10位提高到14位）。这些高性能装置针对SiPM信号处理应用进行了优化。噪波声隔离使用的是数字信号处理滤波器而非模拟电路滤波器，可高效地衰减噪波声，同时尽量减少牺牲信号带宽的情况，以实现更高的信噪比。因此，即使共振扫描振镜的像素数为1k或更大，也能分别探测到传统方法无法分离的高频分量，并获得足够的像素分辨率（时间分辨率）（图9b）。

_{图9.改善降噪对画质和空间分辨率的影响。图9(a)显示的是使用模拟电路滤波器和慢速采样的传统方法；当扫描速度快时，由于信号带宽下降，空间分辨率会降低。图9(b)显示的是高速扫描过程中高速采样与支持数字滤波的降噪组合，同时保持了空间分辨率。}

在现场可编程门阵列上进行实时反变换以消除信号衰减

此外，我们还开发了一项技术，通过在现场可编程门阵列(FPGA)上不受限制地利用高级信号处理来恢复由于信号衰减缓慢（SiPM传感器的一个缺点）而导致的带宽降级。有一种已知的力复位方法可用作消除衰减信号的技术[3]。但我们的技术可以更快地恢复输出信号，而无需传统技术所需的复杂探测电路。

虽然SiPM传感器能准确快速地输出光子探测时间和探测到的光子数量，但它有一个缺点，即输出信号衰减缓慢。使用共振扫描振镜成像时，由于像素停留时间短，衰减信号会泄漏到相邻的像素中，导致像素分辨率和时间分辨率下降（图10a）。

使用SiPM时，总信号输出是每个APD的信号输出之和，与PMT相比，因每个APD的光子入射所产生的输出响应脉冲波形非常稳定，并保持恒定的形状。如果对输入的响应可进行唯一定义，则最终输出可以通过输入响应的卷积和来获得。假设图10b中的光子探测时序及其数量为x(t)，传感器响应为h(t)，则输出y(t)为：

y(t)=(x*h)(t)=∑x(i)h(t-i)

测量包括衰减信号在内的SiPM输出信号y(t)时，如果可以定义传感器响应h(t)，则可以通过执行这种逆变换计算出不包含衰减信号的光子探测事件x(t)。这依据的是与反卷积滤波器[4]相同的概念，后者通常用于消除信号波形的尾部，例如在神经科学领域定量分析钙离子动态变化过程的火花信号时。FPGA具有高速、先进的数字信号处理器(DSP)，可在装置内实时处理逆变换计算。事实上，我们已经开发出一种技术，可以在FPGA上实时获取逆变换传感器信号的输出数据[5]，如图10c所示。

如图10a所示，通过使用该逆变换数据序列计算像素强度，我们避免了衰减信号向邻近像素的泄漏。此外，复原滤波器不仅能消除衰减信号，还能隔离与原始光子探测响应不同的混合噪波声。这进一步提高了信号的信噪比。

_{图10. SiPM衰减信号导致的带宽降级恢复技术概览。 图10(a)显示了传感器衰减信号和空间分辨率的下降； 10(b)显示了SiPM传感器的输入和输出关系；图10(c)显示了通过反卷积估运算的输入信号。}

如图11所示，如果不进行逆变换，图像的像素分辨率会因SiPM信号衰减的影响而降低，尤其是在高速和高分辨率共振扫描期间。另一方面，应用逆变换可在不损失光子输入的情况下恢复时间分辨率，从而在不损失特殊分辨率或探测到的光子的情况下获得高分辨率共振扫描振镜图像（1024个像素/行）。

_{图11.一个示例，显示的是在BPAE细胞中进行和不进行逆变换情况下捕获采集的样品（肌动蛋白[BODIPY FL]）；共振，平均64，ex.488 nm，Em.500–540 nm，激发功率相同；UPLSAPO40x2/NA 0.95，CA 1 AU，1024 × 1024像素。}

高动态范围光子计数

当发生高频光子探测事件时，原始SiPM输出信号更容易发生堆积，例如在信号衰减之前探测到更多光子（图11中的蓝线）。因此，要利用SiPM的高动态范围，模数转换器的转换规模必须大于高频光子探测（包括堆积效应）的信号幅度。另一方面，为了准确执行逆变换过程，必须以精细的分辨率间距探测一个光子的信号幅度（最小信号）。因此，需要分辨率更高的模数转换器，从而以更精细的分辨率捕获采集更小的幅度和更大的堆积累计幅度。此外，如果没有很高的时间分辨率，（即以快速采样率采集许多数字数据序列，），就无法进行逆变换。一般来说，具有用于高速装置的1 GHz采样率的模数转换器的分辨率为8位。但我们通过使用采样率为1 GHz、分辨率为14位（16384等级）的高端模数转换器，并使用高端FPGA对从这些转换器中获取的大容量高速数字数据进行高速处理，实现了这一逆变换过程。

经过逆变换的信号（图11中的橙色线）得到还原，并因消除了衰减信号而保持了时间分辨率。通过调平堆积累堆积信号，可以获得与探测到的光子数量相对应的脉冲输出幅度（波峰值）。换言之，当探测到一个光子时，就会输出相同幅度的脉冲。同样，当同时探测到两个光子时，就会输出两倍幅度的脉冲。如果此后同时探测到多个光子，则输出幅度为单光子幅度整数倍的脉冲。因此，如果在一定的时间间隔内探测到N个光子，则获得的这些输出脉冲的时间积分将是探测到一个光子时的脉冲N倍的积分强度。当在很短的时间内探测到大量光子时，这种关系也同样成立。

因此，即使在短时间内探测到大量光子，这种方法也能以能够分开探测光子的信噪比准确探测到荧光。 在实际应用中，利用这一信噪比每秒最多可检测到1千兆光子而不会出现饱和。 传统的单光子计数（麻瘫痪痹性或非麻痹瘫痪性）[1]只能应用于低频光子探测率，而本技术可实现HDR光子计数，即使对非常明亮的样品进行高速成像，其信噪比也可与单光子计数相媲美（图12）。

_{图12.激发强度与输出信号之间的关系。增加激发功率时，在一定时间内可检测到更多的光子。使用传统的光子计数方法时，探测到的光子率较低时，输出信号就会饱和。SilVIR探测器的HDR光子计数即使在高频入射光子速率下也不会达到饱和。单光子计数曲线是以1.2nsec脉冲对分辨率计算得出。}

4-3.SilVIR探测器的优点

SilVIR探测器系统是SiPM传感器与高速采样数字处理的结合。在上一小节中，我们介绍了理想的LSM荧光探测和传统LSM的状态及其与理想状态的偏差。但我们利用SilVIR探测器实现了接近理想状态的LSM荧光探测。

高灵敏度和信噪比

理想的探测系统应具有较高的光子探测效率(PDE)，并且没有传感器或电路噪波声。

SilVIR探测器使用两种SiPM传感器，在可见光和近红外范围内都实现了较高的PDE，而且在动态范围和信噪比之间不做取舍。此外，在SilVIR探测器中，光子射击散粒噪波声占主导地位，因为电路噪波声被抑制到单光子或更低水平，并且暗电流也小到可以忽略不计。因此，可以根据探测到的光子数量，通过下式估算出大致的信噪比：

信噪比 = N/√N = √N

N：探测到的光子数

由于信噪比更容易量化，因此探测到的光子数可以作为一个有用的指标，用于共享和讨论图像，以及再现日常成像实验中的图像质量。

探测到的荧光强度的定量性

理想的探测器可以在定量尺度上将探测到的荧光量与强度联系起来。但使用传统技术时，这种关系缺乏明确性和确定性。SilVIR探测器可以使用明确的定量标度——光子数——来量化探测到的荧光量。

宽动态范围

理想的探测器应具有宽动态范围，能够在从一个光子到数千个光子的范围内进行探测。但如果使用传统技术，增益高时动态范围窄，增益低时动态范围宽，从而只能在信号和噪波声之间做出取舍。SilVIR探测器的高增益使得可以探测到单个光子，而宽动态范围则可实现在短时间内探测到数千个光子。

简单的探测设置（固定增益）

探测器不应要求进行复杂的设置调整。但传统技术要求用户根据目标荧光的亮度持续调整高电压(HV)。而SilVIR探测器只需要用户调整扫描速度、像素大小和帧积分累计（或平均）帧计数扫描。

图像的强度直方图（如图13所示）显示，SilVIR探测器能以高信噪比分开定量探测荧光信号。在图13中，强度呈现梳状峰值，并且大多数像素的强度都集中在与这些峰值相匹配的强度值上。每个峰值都与上一小节所述的脉冲信号峰值中识别出的探测到的光子数量相对应。例如，如果在某个像素探测到的脉冲信号峰值仅为1个光子，则峰值的强度对应于1个光子；如果在某个像素探测到的脉冲信号峰值为2个光子，则峰值的强度对应于2个光子。同样，即使探测到的光子数量增加，强度值也会转换为探测到的光子的峰值位置。由于这一过程自然包含少量噪波声和误差，当探测到大量光子时，这些误差就会累积起来，在高强度下将难以分辨出梳状峰值。但由于噪波声和误差被抑制到小于一个光子的强度，直方图可以显示分开探测到的光子的梳状峰值。事实上，当我们模拟强度分布时，假设其中包含的噪波声的标准偏差约为一个光子探测强度的1/3，则无法分辨出高于三或四个光子的峰值。

因此，一个光子（光的最小量子单位）可以在足够的信噪比下与噪波声分开探测。这意味着图像的强度仅由在每个像素探测到的光子数所对应的强度组成，被污染噪波声的影响可以被抵消或不被识别。换言之，SilVIR探测器可以获得与使用传统光子计数法所获相当的高信噪比图像。此外，SilVIR探测器即使在对高强度荧光进行高速成像时也能以高信噪比进行探测，而传统的光子计数法只有在对低水平荧光进行延长曝光时间探测时才能正常发挥作用。这些特性使SilVIR成为精密荧光成像的突破性探测器。

在FV4000激光共焦显微镜中，图13横轴上的强度可以转换成探测到的光子数，并作为强度值的替代指标显示在图像上。光子数可以从梳状峰值之间的宽度转换而来，因为峰值之间的间隔相等。具体来讲，SilVIR探测器设计为在探测到一个光子时输出32个计数，而在传统的光子计数中，一个光子等于一个计数。通过我们的方法，即使探测到的光子数量少，采集到的图像也会有一定程度的渐变。因此此外，通过累积或平均低光子数图像，我们可以提高信噪比，同时避免光子数信息埋没在噪波声或误差中。

_{图13.FV4000 SilVIR采集的荧光图像及其像素强度直方图。直方图显示了分开探测到的光子的梳状频率分布。}
 

5. SilVIR探测器示例图像

本小节介绍使用SilVIR探测器捕获采集的LSM图像。

与使用GaAsP-PMT捕获采集的图像的比较

图14显示了SilVIR和GaAsP-PMT探测器捕获采集的绿色荧光图像。样品由相同功率的激光器激发，以达到典型的荧光强度。当强度相对较强时（约128光子），两种图像的画质相似，但SilVIR探测器具有直接的光子计数声明数量显示。

_{图14.SilVIR和GaAsP-PMT探测器都能采集信噪比相当的明亮样品图像。图14(a)是使用SilVIR探测器采集的图像，而图14(b)则是在550 V电压下使用PMT采集的图像。使用了相同功率的激光器对相同的样品进行了激发。最大荧光强度约为128个光子/2 µs。}

_{扫查器描单元： 检流计式扫描单元，2 µs/像素
激发： 488 nm激光器
发射： 500–540 nm
BPAE细胞的肌动蛋白丝(BODIPY FL)}

但在弱荧光情况下并非如此。图15显示了使用两种探测器捕获采集到的具有微弱荧光（约12个光子）的相同样品。可以看出，使用SilVIR探测器捕获采集的图像比使用传统GaAsP-PMT捕获采集的图像噪波声更少。此外，SilVIR图像的强度直方图呈梳状，表明在每个像素都能准确探测到光子数量。而GaAsP-PMT图像的强度直方图则显示，图像强度具有随机性，导致光子定量不足。此外，GaAsP-PMT需要根据待探测荧光的强度来调节高电压，而SilVIR探测器则不需要。

_{图15.该图显示了SilVIR探测器捕获采集的具有微弱荧光的样品(15a)和GaAsP-PMT在700 V电压下捕获采集的相同样品(15b)。使用了相同功率的激光器对相同的样品进行了激发。 最大荧光强度约为12个光子/2 µs。使用SilVIR探测器捕获采集的图像的强度直方图呈现梳状结构，这表明光子数量得到了准确探测。而在使用PMT采集的图像的背景中观察到较多噪波声。}

_{扫查器描单元：检流计式扫描单元，2 µs/像素
激发：488 nm激光器
发射： 500–540 nm
PtK2细胞的微管(Alexa Fluor 488）}

使用SilVIR探测器的共振扫描振镜的高信噪比图像

SilVIR探测器非常适合低强度荧光成像。特别是在使用共振扫描振镜采集图像时，由于像素停留时间极短，探测到的光子数量很少，因此以往难以采集到高信噪比的图像。SilVIR探测器克服了这一问题。图16是用共振扫描振镜以1024 × 1024像素捕获采集的图像。 采用不同次数平均处理的图像排成一行。 即使探测到的光子数量为几个光子水平，也能获得画质良好的共振扫描振镜图像，而且少量的平均（或累积）就能将共振扫描振镜图像处理成与常规扫描振镜质量相当的图像。同时这也提高了图像采集效率。

_{图16.使用SilVIR探测器和1K共振扫描振镜采集的图像。图16(a)显示的是130 msec毫秒/帧下的无平均图像，16(b)为262 msec毫秒/帧下的两次平均图像，16(c)则是522 msec毫秒/帧下的四次平均图像。由于SilVIR探测器可以利用共振扫描振镜采集高信噪比图像，因此少量的平均处理就足以获得高质量的图像。这提高了图像采集效率。}

_{共振扫描振镜：单向1024 × 1024像素，像素停留时间：0.033 µs
最大荧光强度：约20个光子。}

使用SilVIR探测器高效采集拼接图像

要采集大面积的高分辨率图像，通常使用图像拼接技术。使用常规扫描振镜时，这一过程速度缓慢，但将SilVIR探测器与共振扫描振镜配对配合使用，可显著提升这一过程的效率。在图17中，这些四通道1K × 1K像素图像，是在通过一个5 × 5马赛克区域的拼接，八个层Z切片上采集的。使用常规扫描振镜采集图像需要30多分钟，而使用共振扫描振镜只需不到6分钟。

_{图17.使用SilVIR探测器高效采集图像。使用共振扫描振镜采集的拼接Z切片图像的最大强度投影。由于SilVIR探测器的信噪比高，因此可以高效地采集大量图像。}

使用SilVIR探测器采集高动态范围图像

传统PMT成像的动态范围有限；如果样品中混合了明暗物体，则必须优先选择其中之一。例如，在图18中，在采集神经元图像时，为了获取荧光较弱的神经纤维结构的清晰图像，细胞体处不可避免地会达到强度饱和。得益于16位动态范围，SilVIR探测器可以同时采集亮区和暗区，而不会达到饱和。

_{图18.使用SilVIR探测器进行高动态范围成像。图18(a)显示的是一个传统图像，其中一些较亮的细胞体容易饱和，而图18(b)显示的是使用SilVIR探测器捕获采集的图像，其中细胞体和神经纤维都在探测范围内。通过调整伽马显示值增强了暗淡的神经纤维。}

使用SilVIR探测器进行多色成像

利用SilVIR探测器在可见光到近红外范围内的高灵敏度和信噪比，可以实现六色同时成像，同时避免串扰的影响（图16）。730 nm波长激发的荧光染料难以通过GaAsP-PMT探测器成像，但SilVIR探测器却能采集高信噪比图像。FV4000共焦显微镜可配备多达六个通道的探测器，实现六种颜色的同时成像，可在400至900 nm波长范围内达到纳米级精度的光谱分辨率。

_{图19.使用SilVIR探测器和TruSpectral技术同时捕获采集的六色图像。可在可见光到近红外范围内实现同时多色成像。}
 

6. 结语

与传统探测器相比，SilVIR探测器具有许多优点，其中包括：

• 从可见光到近红外波长范围内、具有高灵敏度和高信噪比的多色成像能力。
• 高光子探测分辨率（高速和高动态范围光子计数）。
• 灵敏度无衰减，基于图像亮度量化实验的高实验可重现性，不会造成灵敏度下降。
• 操作简单，无需像使用PMT那样调节增益。

这些优点使得在降低光毒性的同时，更容易获得具有高信噪比的高速、高分辨率图像。 此外，由于可以将图像亮度量化为光子数量，因此共享和再现成像条件更加容易和直观。

此外，SiPM传感器在未来的技术发展中也具有巨大潜力。例如，FF是PDE的决定性参数之一，如果即将推出的单光子雪崩二极管(SPAD)阵列传感器开发中的显微透镜阵列和护环共享技术[6]能够成功部署，那么FF可能会得到大幅度改善。如果能进一步提升PDE，就能更容易地平衡信噪比、动态范围、速度和像素数之间的复杂权衡。

我们相信，SilVIR探测器可以成为新一代激光扫描显微镜的标准，因为它能充分克服与传统探测器相关的挑战，而且在未来还有继续快速发展的潜力。
 

7.参考文献

1. Hamamatsu Photonics “Photomultiplier Tubes: Basics and Applications 4th Edition” (Hamamatsu Photonics, 2017).
2. Hamamatsu Photonics “MPPC®” Cat. No. KAPD9005E04 (Hamamatsu Photonics, 2022).
3. J. Zheng, et al. “Dynamic-quenching of a single-photon avalanche photodetector using an adaptive resistive switch” Nat. Communications 13, Article number 1517 (2022).
4. J.Friedrich, P. Zhou, L. Paninski “Fast online deconvolution of calcium imaging data” PLoS Comput. Biol. 13(3) : e1005423 (2017).
5. Evident corporation, US Patent No. US11237047B2
6. K.Morimoto, E. Charbon “High fill-factor miniaturized SPAD arrays with a guard-ring-sharing technique” Opt. Express 28(9/27), 13068–13080 (2020).
    

8.技术术语解释

外部光电效应：当金属或半导体受到光线照射时，金属或半导体中的电子会因光线的能量而跃迁到外部（真空空间）。
内部光电效应：当半导体或绝缘体受到光照射，导致材料内部电子的传导增加，并且由这种现象引起的导电性增加的现象。
盖革模式：雪崩光电二极管(APD)通过施加电压引发盖革放电的状态。
击穿电压：当对APD施加一定或更高的电压时，无论光量多少，光入射都会产生一定水平的光接收元件所固有的信号输出（盖革放电）。击穿电压是导致这种情况的最小施加电压。
暗计数噪波声：光未入射时产生的噪波声。
串扰噪波声：相邻SiPM像素的光电子泄漏产生的脉冲噪波声。
后脉冲噪波声：响应原始光子探测脉冲的延迟脉冲噪波声。
麻痹瘫痪模型光子计数探测：在光子探测脉冲连续重叠的情况下，一个脉冲无法分离时的单光子计数探测。示例：使用PMT进行的光子计数。
非麻痹瘫痪模型光子计数探测：当光子探测脉冲重叠但信号按脉冲对分辨率间隔输出时的单光子计数探测。这相当于使用SiPM作为探测器。
脉冲对分辨率：单光子计数探测中光子探测脉冲可以分离的最小时间间隔。

作者

Hirokazu Kubo
Evident Corporation研发先进技术部