Nova geração do sistema detector SilVIR para o microscópio confocal a laser FLUOVIEW FV4000

Resumo

A Evident foi pioneira da nova geração do sistema detector SilVIR proprietário para o microscópio confocal a laser FV4000. Este detector estabelece um novo padrão em formação de imagens multicoloridas, oferecendo ruído excepcionalmente baixo e alta sensibilidade com uma relação sinal/ruído (S/R) impressionante em toda a faixa do comprimento de onda visível ao infravermelho próximo. Com sua capacidade de detectar fótons com precisão, incluindo contagem de fótons em alta velocidade e alta variação dinâmica, o detector SilVIR ajuda a garantir a repetibilidade experimental. Alèm disso, ele apresenta uma experiência operacional simplificada, eliminando a necessidade de ajustes de ganho normalmente necessários com os detectores de tubos fotomultiplicadores GaAsP. Seu excelente desempenho coloca o detector SilVIR no caminho para se tornar o novo padrão da indústria para microscopia de escaneamento a laser.
 

1. Introdução

Tubos fotomultiplicadores (PMTs), que podem detectar luz fraca em vários níveis de fótons com alta sensibilidade e alto ganho, têm sido os detectores padrão para microscopia de escaneamento a laser (LSM) para capturar luz fluorescente muito fraca. No entanto, há uma série de questões associadas às LSMs que usam PMTs, que serão discutidas nas seções a seguir.

O sistema detector SilVIR usa um sensor do tipo semicondutor para detectar fluorescência. Este fotomultiplicador de silício (SiPM) elimina muitos dos problemas e restrições dos PMTs convencionais. O circuito de processamento de sinal também incorpora tecnologia que maximiza as capacidades do sensor, expandindo sua aplicabilidade para formação de imagens com alto número de pixels e alta velocidade (Figura 1).

Neste artigo, descrevemos os problemas relacionados à formação de imagens da LSM convencional usando detectores de PMT e descrevemos como o detector SilVIR pode resolvê-los.

_{Figura 1. Os dispositivos que compõem o detector SilVIR: (a) o detector de fluorescência FV4000; (b) um gráfico que mostra a sensibilidade espectral do detector SilVIR: o detector tem uma sensibilidade mais alta do que os PMTs GaAsP convencionais de alta sensibilidade de 400 nm a 900 nm usando um tipo de banda larga e um tipo com desvio para o vermelho; (c) o detector SilVIR é composto por um sensor SiPM, amostragem A/D de 1 GHz e processamento de sinal digital.}
 

2. As necessidades dos microscopistas de escaneamento a laser – Construindo um detector melhor 

As reclamações comuns dos usuários de LSM incluem:

• Confusão sobre quais configurações ajustar para maximizar o desempenho do dispositivo.
• Fotobranqueamento e fototoxicidade em excesso.
• Saturação não intencional dos detectores.
• A necessidade de melhor qualidade de imagem, resolução e taxa de frames.
• Incapacidade de adquirir imagens melhores.

A raiz destas reclamações é o detector de PMT e o seu principal método de funcionamento. A seguir, discutimos alguns dos fatores que consideramos ao construir um detector melhor.

Alta sensibilidade e relação sinal/ruído (S/R)

Para detectar com eficiência até mesmo uma pequena quantidade de fótons incidentes (como é necessário para formação de imagens com sinais fluorescentes fracos), é essencial que o detector tenha uma eficiência quântica (QE) e uma eficiência de fotodetecção (PDE) altas. Além disso, o ruído intrínseco do circuito do sensor e do detector deve ser insignificante para obter uma relação S/R alta.

Quantificação da luz detectada

Embora existam várias definições da medição física da luz detectada, a quantificação do "número de fótons" é a forma mais precisa de quantificar a luz fluorescente muito fraca. Por este motivo, a forma mais simples de medir a intensidade é o número de fótons detectados (Figura 2).

Quantificar a intensidade da fluorescência usando um valor numérico é muito importante. Por exemplo, isto possibilita reproduzir os mesmos resultados de formação de imagens em diferentes instrumentos porque não é um valor específico do dispositivo. Além disso, como o valor do número de fótons é universal, os pesquisadores podem compartilhar dados entre si com mais facilidade. Por último, os valores quantitativos podem ser usados como um indicador para imagens de pré-processamento durante a análise.

_{Figura 2. O processo de detecção de fluorescência começa quando os fótons incidem na superfície do fotossensor. Os fótons detectados são então convertidos em elétrons e amplificados e emitidos como uma corrente elétrica. A corrente é convertida de analógico para digital após passar pelo circuito de amplificação. Em seguida, o sinal digitalizado é convertido em um valor de intensidade para cada pixel por processamento aritmético e é visualizado como cada pixel da imagem pelo software.}

Alta variação dinâmica

Mesmo que os itens acima possam ser realizados, se o número máximo de fótons detectáveis em um determinado tempo (conhecido como variação dinâmica) for pequeno, a saturação de intensidade ocorrerá nas regiões onde a intensidade da fluorescência é alta e a quantificação será perdida. Além disso, uma das maneiras de melhorar a qualidade da imagem é suprimir o ruído de fótons (o ruído probabilístico de detecção de fótons no sensor, também conhecido como ruído de disparo), aumentando a emissão de fótons com excitação forte. Imagens de alta qualidade podem ser capturadas sem saturar o brilho quando a variação dinâmica é alta. Por exemplo, como mostrado na Figura 3, quanto mais luz fluorescente for detectada pela excitação mais forte à direita, melhor será a qualidade da imagem. No entanto, em última análise, a saturação dos detectores comprometerá muitas etapas de pós-processamento e análise.

Ganho consistente do detector para quantificação de imagens

O ideal é ter alta variação dinâmica sem alterar as condições do detector ou circuito. Por exemplo, se o ganho do detector for alterado para estender a variação superior, a intensidade resultante da imagem também muda. Porém, esta relação não é linear, dificultando a estimativa inversa da quantidade de luz detectada apenas a partir da imagem obtida. Uma curva de calibração deve ser preparada separadamente para correção. Por outro lado, os gráficos de linhas na Figura 3 mostram o perfil de brilho em toda a linha A em cada imagem. Quando eles são obtidos com uma configuração do detector fixo, o número de fótons detectados em cada pixel pode ser estimado quantitativamente a partir da intensidade de qualquer imagem.

_{Figura 3. A relação entre intensidade da fluorescência e qualidade de imagem. A relação sinal/ruído é determinada pela intensidade da fluorescência/√intensidade da fluorescência.}
 

3. Problemas do detector de PMT convencional na formação de imagens da LSM

A seguir, discutimos os principais problemas ao usar um detector de PMT para microscopia de escaneamento a laser.

É difícil alcançar uma alta sensibilidade e alta relação S/R

Atualmente, é comum o uso de PMTs do tipo fotocátodo GaAsP [1], cujo QE na variação visível foi aprimorado em 40% ou mais, como um detector de alta sensibilidade. Por causa do ruído dos sensores e circuitos, geralmente ele tem sido usado amplificando o sinal com um maior ganho para evitar que o ruído relativo afete a imagem. Um PMT também converte fótons em elétrons na superfície receptora de luz, que então passam por um processo de amplificação aleatório de várias etapas para gerar um sinal de corrente (Figura 4). Por este motivo, mesmo se o número de fótons detectados for constante, a saída muda toda vez devido à flutuação aleatória. Isso pode reduzir a relação S/R da imagem, particularmente para formação de imagens de alta velocidade e pixels altos com menos fótons detectados.

_{Figura 4. A estrutura das características de entrada-saída de um PMT. Quando os fótons incidem no fotocátodo, os elétrons emitidos pelo fotocátodo são amplificados em um tubo de observação de vácuo. Como os elétrons secundários são amplificados repetidamente em várias cadeias de dínodos, o sinal de pulso de saída ao detectar um fóton não é uniforme nem estável.}

Baixa quantitatividade de intensidade para fótons detectados

Conforme descrito acima, um PMT tem uma variação aleatória durante a amplificação de fotoelétrons. Por este motivo, a quantitatividade de entrada/saída é baixa, particularmente quando a taxa de detecção de fótons é baixa. Além disso, embora o ganho possa ser ajustado variando a tensão aplicada entre os eletrodos, a relação correspondente entre entrada e saída também muda. Além disso, mesmo se a mesma tensão for aplicada, o ganho real varia muito entre cada PMT devido a diferenças individuais. E quando a tensão aplicada é ajustada em um nível baixo para amplificar uma determinada quantidade de luz, a mudança de ganho em resposta à tensão aplicada torna-se fraca e piora a linearidade. [1]

Além disso, os seguintes fenômenos inevitáveis farão com que a sensibilidade do PMT se deteriore de acordo com os fótons detectados acumulados pelo uso.

• Quando os fótons entram no fotocátodo, elétrons são emitidos do fotocátodo para o tubo de observação de vácuo devido ao efeito fotoelétrico externo. O fotocátodo se deteriora porque os elétrons não podem ser totalmente repostos.
• Degradação de dínodos devido à colisão com elétrons (fotoelétrons) emitidos pelo fotocátodo.
• Deterioração do fotocátodo ou dínodos devido à colisão com íons gerados pela colisão de fotoelétrons com gás residual ou impurezas no tubo de observação de vácuo.
• Diminuição do vácuo devido a impurezas geradas a partir de dínodos devido à colisão de fotoelétrons com dínodos.

Devido ao exposto acima, as LSMs que usam PMTs não podem fornecer quantitatividade entre a quantidade de luz detectada e a intensidade da imagem.

É difícil alcançar uma alta variação dinâmica e alta relação S/R

Quando o ganho do sensor é aumentado, um sinal fraco de alguns fótons ainda pode ser detectado apesar do ruído, permitindo que uma alta relação S/R seja alcançada. Mas o limite superior da corrente de saída do PMT é tão baixo quanto vários μA. Se o ganho for definido como alto, a saída será facilmente saturada, mesmo pelo pequeno número de fótons de detecção, resultando em uma pequena variação dinâmica (Figura 5a). Por outro lado, se o ganho for baixo, o sinal de saída não ficará saturado mesmo quando for detectada fluorescência forte (um grande número de fótons) e a variação dinâmica será maior. No entanto, a fluorescência fraca, como vários fótons, não será amplificada e ficará enterrada no ruído, causando a deterioração da relação S/R (Figura 5b). O resultado é que o usuário precisa ajustar manualmente o ganho do detector de acordo com o brilho do objeto e o nível de qualidade de imagem necessário. Além disso, existe uma desvantagem de a variação dinâmica e a relação S/R serem alteradas involuntariamente devido a este ajuste.

_{Figura 5. Ajustar o ganho de um PMT exige equilibrar a relação sinal/ruído e a variação dinâmica; (a) alto ganho - o sinal de saída pode ser amplificado mais alto que o ruído ao detectar um fóton, mas reduz a variação dinâmica e é fácil de ficar saturado; (b) baixo ganho - o sinal de saída não pode ser distinguido do ruído ao detectar alguns fótons. Por outro lado, a variação dinâmica é maior e não fica saturada ao detectar um grande número de fótons.}

Configurações de detecção complexas

Ajustar as configurações do detector para obter qualidade de imagem satisfatória ao mesmo tempo em que evita a saturação de brilho é complicado, dificultando a vida de usuários não qualificados em LSM. Para fins explicativos, a Figura 6 mostra esferas fluorescentes com diferentes intensidades de fluorescência causadas por diferentes configurações de ganho do detector.

A Figura 6a mostra as esferas sob diferentes excitações adquiridas com alto ganho. As esferas escuras mal podem ser distinguidas do ruído, mesmo por excitação fraca (imagem mais à esquerda da figura), mas as esferas claras ficaram saturadas quando a luz de excitação aumentou (as duas porções da esfera clara no lado direito da figura).

Por outro lado, a Figura 6b mostra as mesmas imagens de esferas fluorescentes adquiridas usando um ganho menor. O sinal das esferas escuras sob excitação fraca (as duas no lado esquerdo do diagrama) foi enterrado no ruído. Ele é superior ao alto ganho porque as esferas claras não saturaram mesmo quando a excitação foi definida para o nível mais alto (lado mais à direita do diagrama), mas não teve uma relação S/R melhor do que a imagem mais à direita da Figura 6a (imagem capturada usando alto ganho) ao focar na relação S/R das esferas escuras.

Imagens fluorescentes típicas de amostras de células têm diferenças significativas de brilho por região e imagens de lapso de tempo ou pilha Z podem ter diferenças ainda maiores de brilho em toda a pilha. É difícil, mesmo para usuários experientes, encontrar as configurações ideais do detector para obter imagens com uma relação S/R satisfatória em áreas escuras sem saturar as áreas claras. Muitos usuários fazem ajustes na forma de tentativa e erro do ganho do detector, intensidade da luz de excitação, duração da exposição, etc. e isso pode fazer com que os microscopistas adquiram muitas imagens com falha.

Quando a relação S/R é insuficiente devido a configurações do detector que não causam saturação, o S/R pode ser melhorado capturando vários frames e calculando a média ou acumulando-os para suprimir apenas o ruído aleatório. Neste caso, muitos frames precisam ser capturados e isso resulta em uma queda significativa na taxa de frames da formação de imagens reais.

Como descrito acima, ajustar os parâmetros de formação de imagens complicados, como ganho do detector, intensidade da luz de excitação e duração da exposição, bem como o número de tempos médios entre frames é necessário para a LSM convencional usando PMTs.

_{Figura 6. Ajustar o ganho de um PMT exige equilibrar a relação sinal/ruído e a variação dinâmica, o que pode ser difícil. As imagens foram adquiridas usando diferentes configurações de laser de excitação, com as imagens à direita sendo adquiridas usando uma configuração mais alta. Os gráficos abaixo das imagens mostram o perfil de intensidade ao longo da linha A. A relação sinal/ruído é a relação entre S (a altura do perfil) e Ns (ruído de fóton) e Nd (ruído do circuito). A Figura 6a mostra amostras adquiridas usando alto ganho. As esferas escuras têm uma relação S/R mais alta, mas as esferas mais claras ficam saturadas. A Figura 6b mostra amostras adquiridas usando baixo ganho. As esferas escuras têm uma relação S/R mais baixa, mas as esferas claras não ficam saturadas.}

Problemas do circuito de detecção

Também existem problemas no circuito de detecção, bem como nos sensores. Como o sinal do sensor e seu circuito amplificador são ruidosos, a relação S/R torna-se muito baixa quando o sinal bruto amostrado pelos conversores de analógico para digital (AD) é processado como dados de pixel (Figura 7a, à esquerda). Em geral, esta relação S/R pode ser melhorada para ser equivalente ao valor real da intensidade fluorescente por amostragem do sinal após suavização com um filtro low-pass ou integrador no circuito de detecção analógico (Figura 7a, à direita). No entanto, quanto mais rápida for a velocidade de escaneamento, como um escâner ressonante, menor será o tempo necessário para percorrer a estrutura da amostra. A Figura 7b mostra a imagem fluorescente da mesma estrutura como mostrada na Figura 7a, exceto que ela é escaneada com o dobro da velocidade em comparação com a Figura 7a. Se um filtro low-pass (LPF) para redução de ruído for aplicado da mesma maneira, a resolução temporal para resolver as estruturas finas com alta frequência espacial será insuficiente e a resolução espacial da imagem resultante será degradada (Figura 7b, à direita).

Quando a frequência de corte dos filtros low-pass é aumentada, a resolução temporal melhora. No entanto, a eficácia da supressão de ruído é degradada e a relação S/R deteriora-se. Para evitar uma diminuição na relação S/R, mesmo que a frequência de corte dos filtros low-pass seja aumentada, é necessário aumentar a taxa de amostragem dos conversores AD de várias vezes para várias dezenas de vezes o clock do pixel para realizar um grande número de amostragens dentro de um pixel (sobreamostragem). Além disso, a velocidade de escaneamento mais rápida e o número de pixels mais alto diminuem o tempo de permanência de um pixel, razão pela qual é necessária uma velocidade de amostragem mais rápida dos conversores AD.

Para suavização de ruído, outro problema é que o circuito analógico só pode adotar um filtro simples (como um filtro low-pass) em detrimento da resolução de tempo. É desejável um método de filtro que separe apenas o ruído sem sacrificar a resolução do tempo, aplicando filtros avançados de processamento de sinal digital em dados amostrados em alta velocidade.

_{Figura 7. O efeito da redução do ruído na qualidade da imagem e na resolução espacial. A Figura 7a foi capturada na velocidade de escaneamento padrão e a qualidade da imagem foi melhorada com a redução do ruído. A Figura 7b foi capturada em uma velocidade de escaneamento duas vezes mais rápida do que a usada em 7(a) e você pode ver que a resolução espacial é degradada devido à queda na largura de banda do sinal.}

Os problemas de formação de imagem da LSM acima causados por PMTs podem ser resolvidos usando nosso detector SilVIR, que combina um novo sensor SiPM do tipo semicondutor com amostragem digital de alta velocidade. Na próxima seção, explicaremos como resolvemos os problemas acima usando nossas tecnologias avançadas.
 

4. Introdução técnica ao detector SilVIR

4-1. Recursos do SiPM

O sensor SiPM no núcleo do detector SilVIR é um sensor semicondutor composto por uma matriz bidimensional de milhares de fotodiodos de avalanche de modo Geiger (APDs; fotodiodo de avalanche de contagem de fótons únicos, ou SPAD). Os sinais detectados são emitidos como a soma de todos os APDs [2] (Figura 8).

O modo Geiger permite que a incidência de um fóton seja detectada em altos níveis de sinal por um processo de multiplicação altamente estável, apesar do alto ganho. Além disso, o processo de fabricação de semicondutores permite um controle preciso sobre as variações individuais dos SiPMs. Através da produção em massa consistente, as diferenças na eficiência de fotodetecção (PDE) e no ganho entre os SiPMs podem ser minimizadas em alto grau. Além disso, mesmo que muitos fótons incidam ao mesmo tempo, a soma das respectivas correntes APD é emitida pelo SiPM, de modo que o limite superior da corrente de saída é alto, resultando em uma ampla variação dinâmica para detectar um grande número de fótons incidentes. Em outras palavras, o sinal de um fóton pode ser multiplicado com alto ganho e ter uma ampla variação de detecção. Isto possibilita alcançar uma elevada relação sinal/ruído e uma ampla variação dinâmica simultaneamente, eliminando a necessidade de comprometimento entre os dois ajustando o ganho.

Além disso, a conversão fotoelétrica por um SiPM, como os fotodiodos, usa o efeito fotoelétrico interno onde os elétrons são excitados da banda de valência para o condutor. Por este motivo, os elétrons são reabastecidos rapidamente quando estão excitados. O resultado é que a sensibilidade e o ganho não são degradados, mesmo que haja uma grande quantidade de luz incidente.

_{Figura 8. A estrutura de um sensor fotomultiplicador de silício (SiPM) e suas características de entrada-saída. A Figura 8(a) mostra que um SiPM é composto por APDs multipixels. Quando um fóton incide na superfície receptora de fótons do APD, o sinal de corrente é emitido pela conversão fotoelétrica interna seguida pela amplificação de elétrons de avalanche na camada de avalanche. A Figura 8(b) mostra que quando vários fótons incidem simultaneamente, o sinal de saída é a soma do sinal do APD. A forma de onda de saída do APD em resposta ao fóton detectado é constante e estável.}  

Além disso, o sensor SiPM tem excelentes características de sensibilidade. A Figura 1b mostra a sensibilidade espectral do sensor SiPM. Usando uma combinação de sensores SiPM com diferentes sensibilidades espectrais, que chamamos de detector de silício de banda larga (BSD) e detector de silício com desvio para o vermelho (RSD), você pode obter melhor sensibilidade do que um detector de PMT GaAsP na faixa de comprimento de onda visível (400 nm) até o infravermelho próximo (900 nm). A eficiência de detecção de fótons (PDE) do SiPM é definida pela equação:

PDE = QE × FF × AP

QE: eficiência quântica
FF: eficiência de abertura (fator de preenchimento)
AP: probabilidade do modo Geiger (probabilidade de avalanche)

A FF é determinada pela área do APD na superfície receptora de fótons SiPM em relação à área da zona morta entre os pixels do APD. A AP depende da tensão aplicada ao SiPM (quanto maior a tensão, maior será o PDE que pode ser alcançado). Por outro lado, aumentar a tensão aplicada aumentará o ruído do sensor. Por exemplo, no modelo S13360-3050 fabricado pela Hamamatsu Photonics, o PDE pode ser aumentado em cerca de 1,4 vezes aumentando a sobretensão (tensão aplicada acima da tensão de ruptura) de 3 V a 7 V, mas o ruído de contagem escura é aumentado em cerca de 2 vezes, o ruído de diafonia em mais de 2 vezes e o ruído pós-pulso em mais de 3 vezes [2]. Este aumento de ruído compensará os benefícios do aumento do PDE e, consequentemente, não melhorará a relação S/R. Além disso, o aumento do ruído dificulta muito a quantidade da detecção de fótons, que é um dos principais benefícios dos SiPMs. E como o ganho também é aumentado por um fator de dois ou mais, a variação dinâmica de detecção torna-se menor. Um exemplo ilustrativo das potenciais armadilhas de focar apenas em valores elevados de PDE ou QE serve como um lembrete para evitar perseguir cegamente tais características, uma vez que podem resultar em perdas não intencionais. Por este motivo, o microscópio confocal FV4000 usa um SiPM com sobretensão ideal para obter nível de ruído e sensibilidade equilibrados e uma excelente variação dinâmica para detecção de fluorescência.

O fato de um SiPM ter um ruído de contagem escura mais alto do que um PMT é frequentemente citado como uma desvantagem. Como contramedida, a superfície receptora de fótons é refrigerada a aproximadamente -20 °C (-4 °F) para reduzir o ruído da contagem escura para entre vários quilocontas a várias dezenas de quilocontas por segundo. Mas isso ainda é maior que o PMT refrigerado. No entanto, quando um SiPM com um ruído de contagem escuro de 10 quilocontas por segundo é usado para escaneamento a 512 pixels/linha com tempo de permanência de 2 µs/pixel, um ruído de contagem escuro equivalente a 1 fóton aparece em apenas cerca de 10 pixels por 1 linha. Nesta quantia, há pouco impacto na qualidade da imagem de LSM.

Outra desvantagem de usar um SiPM como um detector de LSM é que uma longa deterioração de cauda pode permanecer no sinal de saída (Figura 8). Isso causa um problema na formação de imagens de alta velocidade, mas conforme descrito na próxima seção, resolvemos esse problema com sucesso com a implementação de uma solução de circuitos de detecção inovadora.

4-2. Recursos de amostragem de alta velocidade e de processamento digital

Conforme descrito acima, os sistemas convencionais equilibraram a relação S/R e a resolução temporal combinando suavização de sinal usando filtragem de circuito analógico com a frequência de amostragem AD mínima necessária (um período de amostragem de cerca de 1/2 do período de pixel) para resolução de pixel. No entanto, esta solução foi tecnicamente limitada para responder ao maior número de pixels (período de pixel mais curto) pelo escâner ressonante de alta velocidade (Figura 9a).

Amostragem AD de alta velocidade

Conseguimos uma taxa de amostragem AD de 1 GHz, que é 12 vezes mais rápida que a taxa de amostragem convencional e adotamos um método de sobreamostragem no qual uma grande quantidade de amostragem é realizada dentro de um período de pixel. Como a saída de um sensor SiPM tem uma ampla variação dinâmica, a variação do seu sinal de saída também é muito grande em comparação com um PMT. Junto com a maior taxa de amostragem AD, a precisão da resolução de amplitude é 16 vezes maior (de 10 bits a 14 bits) do que os dispositivos convencionais. Esses dispositivos de alto desempenho são otimizados para aplicações de processamento de sinais SiPM. O isolamento de ruído usa um filtro de processamento de sinal digital em vez de um filtro de circuito analógico, que atenua eficientemente o ruído enquanto minimiza o sacrifício da largura de banda do sinal para alcançar uma relação S/R mais alta. Como resultado, componentes de alta frequência que não puderam ser separados pelo método convencional podem ser detectados separadamente e resolução de pixels suficiente (resolução temporal) pode ser alcançada, mesmo se o número de pixels do escâner ressonante for 1k ou maior (Figura 9b ).

_{Figura 9. O efeito da redução de ruído aprimorada na qualidade da imagem e na resolução espacial. A Figura 9(a) mostra o método convencional com um filtro de circuito analógico e amostragem em baixa velocidade; a resolução espacial é degradada devido à queda da largura de banda do sinal quando o escaneamento é rápido. A Figura 9(b) mostra uma combinação de amostragem de alta velocidade e redução de ruído habilitada por filtro digital durante um escaneamento de alta velocidade, mantendo a resolução espacial.} 

Transformação inversa em tempo real no conjunto de portas programáveis em campo para eliminar a deterioração do sinal

Além disso, desenvolvemos uma técnica para restaurar a degradação da largura de banda devido à deterioração do sinal lenta, que é uma desvantagem dos sensores SiPM, usando processamento avançado de sinal no arranjo de portas programável em campo (FPGA) sem restrições. Como uma técnica para eliminar o sinal de deterioração, existe um método de redefinição de força conhecido [3]. No entanto, a nossa técnica pode restaurar o sinal de saída a uma velocidade mais elevada sem os complicados circuitos de detecção exigidos pela técnica convencional.

Embora um sensor SiPM possa gerar o tempo de detecção de fótons e o número de fótons detectados com precisão e rapidez, ele tem uma desvantagem: um sinal de saída que deteriora lentamente. Ao formar imagens usando um escâner ressonante, o curto tempo de permanência do pixel causa o vazamento de um sinal de deterioração em pixels adjacentes, o que degrada a resolução do pixel e a resolução temporal (Figura 10a).

Usando um SiPM, a saída total do sinal é a soma das saídas de sinal de cada APD e a forma de onda de pulso de resposta de saída criada em resposta à incidência de fótons de cada APD é muito estável e mantém uma forma constante em comparação com um PMT. Se a resposta à entrada puder ser definida de forma única, a saída final pode ser obtida pela soma da convolução da resposta à entrada. Supondo que o tempo de detecção de fótons e seu número sejam x(t) na Figura 10b e a resposta do sensor seja h(t), a saída y(t) é:

y(t)=(x*h)(t)=∑x(i)h(t-i)

Quando o sinal de saída SiPM y(t), incluindo o sinal de deterioração, é medido, se a resposta do sensor h(t) puder ser definida, o evento de detecção de fótons x(t) que não contém nenhum sinal de deterioração pode ser calculado executando esta transformação inversa. Isto se baseia no mesmo conceito de um filtro de deconvolução [4], que é frequentemente aplicado para eliminar a cauda da forma de onda do sinal, por exemplo, ao analisar quantitativamente sinais de faísca da dinâmica de íons de cálcio no campo da neurociência. O FPGA tem um processador de sinal digital (DSP) avançado e de alta velocidade que permite o processamento em tempo real de cálculos de transformação inversa dentro do dispositivo. Na verdade, desenvolvemos uma técnica para obter os dados de saída do sinal do sensor transformado inversamente no FPGA em tempo real [5], como mostrado na Figura 10c.

Ao calcular a intensidade dos pixels usando essa sequência de dados transformada inversamente, eliminamos o vazamento do sinal de deterioração para os pixels vizinhos, como mostrado na Figura 10a. Além disso, os filtros de restauração não apenas removem o sinal de deterioração, mas também isolam ruídos mistos, que diferem da resposta original de detecção de fótons. Isto melhora ainda mais a relação S/R do sinal.

_{Figura 10. Uma visão geral da técnica para restaurar a degradação da largura de banda devido ao sinal de deterioração do SiPM. A Figura 10(a) mostra o sinal de deterioração do sensor e degradação da resolução espacial; 10(b) mostra a relação de entrada e saída do sensor SiPM; e 10(c) mostra a estimativa do sinal de entrada por deconvolução.} 

Como mostrado na Figura 11, se não houver transformação inversa, a resolução do pixel da imagem é degradada pelo efeito da deterioração do sinal SiPM, particularmente durante o escaneamento ressonante de alta velocidade e alta resolução. Por outro lado, a aplicação da transformação inversa restaura a resolução temporal sem perder a entrada de fótons, possibilitando a obtenção de uma imagem de escâner ressonante de alta resolução (1024 pixels/linha) sem perda de resolução especial e/ou fótons detectados.

Contagem de fótons de alta variação dinâmica

Os sinais de saída SiPM brutos são mais propensos a serem empilhados quando ocorrem eventos de detecção de fótons de alta frequência, como a detecção de mais fótons antes da deterioração do sinal (a linha azul na Figura 11). Por este motivo, para aproveitar a alta variação dinâmica do SiPM, a escala de conversão do conversor AD precisa ser maior que a amplitude do sinal de detecção de fótons de alta frequência, incluindo o efeito de empilhamento. Por outro lado, para realizar o processo de transformação inversa com precisão, a amplitude do sinal de um fóton, que é o sinal menor, deve ser detectada com um passo de resolução fino. Assim, um conversor AD com resolução mais alta é necessário para capturar amplitudes menores com resolução mais fina e amplitudes de empilhamento maiores. Além disso, a transformação inversa não é possível sem uma resolução de tempo muito elevada, isto é, muitas sequências de dados digitais adquiridas a taxas de amostragem rápidas. Geralmente, conversores AD com taxa de amostra de 1 GHz para dispositivos de alta velocidade têm um grau de resolução de 8 bits. No entanto, alcançamos esse processo de transformação inversa usando conversores AD de última geração com taxa de amostra de 1 GHz, resolução de 14 bits (gradação 16384) e processamento de alta velocidade de dados digitais de grande capacidade e alta velocidade obtidos a partir desses conversores usando um FPGA de última geração.

O sinal transformado inversamente (a linha laranja da Figura 11) é restaurado, mantendo a resolução temporal através da remoção do sinal de deterioração. Ao nivelar os sinais empilhados, é possível obter a amplitude de saída do pulso (valor do pico da onda) correspondente ao número detectado de fótons. Em outras palavras, quando um fóton é detectado, pulsos com a mesma amplitude são emitidos. Da mesma forma, quando dois fótons são detectados simultaneamente, pulsos com uma amplitude duas vezes maior são emitidos. Se os fótons forem simultaneamente detectados posteriormente, os pulsos serão emitidos com uma amplitude que é um múltiplo inteiro daquele fóton. Por este motivo, se N fótons forem detectados dentro de um determinado intervalo de tempo, a integração temporal desses pulsos de saída pode ser obtida como a intensidade integrada de N vezes o pulso no momento da detecção de um fóton. Esta relação também é verdadeira quando um grande número de fótons é detectado em um tempo muito curto.

_{Figura 11. Um exemplo que mostra uma amostra capturada com e sem transformação inversa (Actina (BODIPY FL) em uma célula BPAE; ressonante, média 64, por exemplo, 488 nm, Em. 500–540 nm, mesmo poder de excitação; UPLSAPO40x2/NA 0,95, CA 1 UA, 1024 × 1024 pixels.}

Consequentemente, este método permite a detecção precisa de luz fluorescente, mesmo quando um grande número de fótons é detectado em um curto intervalo de tempo, com uma relação S/R que é capaz de detectar fótons discretamente. Como medida prática, até 1 gigafóton por segundo pode ser detectado com esta relação S/R sem saturação. Embora o método convencional de detecção de contagem de fótons únicos (paralítico ou não paralítico) [1] só possa ser aplicado em taxas de detecção de fótons de baixa frequência, a presente técnica alcança a contagem de fótons de alta variação dinâmica, que é comparável em S/R ao método de detecção da contagem de fótons, mesmo quando a formação de imagens de amostras muito claras em alta velocidade (Figura 12).

_{Figura 12. A relação entre a intensidade de excitação e o sinal de saída. O maior número de fótons por um determinado tempo pode ser detectado ao aumentar a potência de excitação. O sinal de saída fica saturado a uma baixa taxa de fótons detectada usando um método de contagem de fótons convencional. A contagem de fótons de alta variação dinâmica pelo detector SilVIR não fica saturada, mesmo em uma taxa de fótons incidentes de alta frequência.  As curvas gráficas da contagem de fótons únicos foram calculadas com resolução de par de pulsos de 1,2 ns.} 

4-3. Vantagens do detector SilVIR

O sistema detector SilVIR é uma combinação de um sensor SiPM e processamento digital amostrado de alta velocidade. Na seção anterior, descrevemos a detecção ideal de fluorescência da LSM e o status da LSM convencional e como ela se desvia da ideal. No entanto, percebemos uma detecção de fluorescência da LSM quase ideal usando o detector SilVIR.

Alta sensibilidade e relação S/R

Um sistema de detecção ideal deve ter eficiência de detecção de fótons (PDE) alta e nenhum sensor ou ruído no circuito elétrico.

Usando dois tipos de sensores SiPM, o detector SilVIR atinge um PDE mais alto tanto na variação visível quanto no NIR, sem compensações entre a variação dinâmica e a relação S/R. Além disso, o ruído de disparo de fótons é dominante no detector SilVIR porque o ruído do circuito elétrico é suprimido por um nível de fóton ou menos e a corrente escura é insignificantemente pequena. Assim, a relação S/R aproximada pode ser estimada a partir do número de fótons detectados pela seguinte equação:

Relação S/R = N/√N = √N

N: número de fótons detectados

Como a relação S/R pode ser quantificada mais facilmente, o número de fótons detectados pode ser um indicador útil para compartilhar e discutir imagens e para reproduzir a qualidade das imagens em um experimento cotidiano de formação de imagem.

Quantitatividade da intensidade da fluorescência detectada

Um detector ideal pode relacionar a quantidade de fluorescência detectada e a intensidade em uma escala quantitativa. No entanto, usando tecnologia convencional, esta relação era confusa e incerta. O detector SilVIR pode quantificar a quantidade de fluorescência detectada usando uma escala quantitativa clara: o número de fótons.

Ampla variação dinâmica

Um detector ideal deve ter uma ampla variação dinâmica para ser capaz de detectar desde um fóton até milhares de fótons. Entretanto, usando tecnologia convencional, a variação é limitada quando o ganho é alto e amplo quando o ganho é baixo, forçando uma troca entre sinal e ruído. O alto ganho do detector SilVIR permite a detecção de fótons únicos, enquanto sua ampla variação dinâmica permite a detecção de milhares de fótons em um curto intervalo de tempo.

Configurações de detecção simples (ganho fixo)

Um detector não deve exigir ajustes de configuração complicados. No entanto, a tecnologia convencional exige que os usuários ajustem continuamente a alta tensão (HV), dependendo do brilho da fluorescência alvo. O detector SilVIR, por outro lado, exige apenas que os usuários ajustem a velocidade de escaneamento, o tamanho do pixel e a contagem de integração (ou média) de frames.

O histograma de intensidade de uma imagem, como o da Figura 13, mostra que o sinal fluorescente pode ser detectado de forma discreta e quantitativa pelo detector SilVIR em uma alta relação S/R. Na Figura 13, a intensidade aparece com picos em forma de pente, e a intensidade da maioria dos pixels está concentrada em valores de intensidade que correspondem a esses picos. Cada pico corresponde ao número de fótons detectados identificados a partir do valor de pico do sinal de pulso conforme descrito na seção anterior. Por exemplo, se o valor de pico do sinal de pulso detectado em determinado pixel for apenas 1 fóton, a intensidade do pico corresponde a 1 fóton, e se o valor de pico do pulso detectado em um determinado pixel for de 2 fótons, a intensidade do pico corresponde a dois fótons. Da mesma forma, mesmo que o número de fótons detectados aumente, o valor da intensidade é convertido na posição de pico do fóton detectado. Como esse processo contém naturalmente uma pequena quantidade de ruído e erros, quando um grande número de fótons é detectado, esses erros se acumulam e os picos em forma de pente são difíceis de resolver em alta intensidade. Entretanto, como o ruído e os erros são suprimidos para valores menores que a intensidade de um fóton, o histograma pode mostrar picos em forma de pente de fótons detectados discretamente. Na verdade, quando simulamos a distribuição de intensidade supondo que ela contém ruído com um desvio padrão de cerca de 1/3 da intensidade de detecção de um fóton, picos superiores a três ou quatro fótons não podem ser resolvidos.

Assim, um fóton, que é a menor unidade quântica de luz, pode ser detectado separadamente do ruído em uma relação S/R suficiente. Isso significa que a intensidade da imagem é composta apenas pela intensidade correspondente ao número de fótons detectados em cada pixel e o efeito do ruído contaminado pode ser negado ou não reconhecido. Em outras palavras, o detector SilVIR pode obter imagens com alta relação S/R equivalente à imagem obtida pelo método de contagem de fótons tradicional. Além disso, o detector SilVIR pode detectar uma alta relação S/R mesmo ao formar imagens de fluorescência de alta intensidade em alta velocidade, enquanto o método de contagem de fótons tradicional funciona bem apenas ao detectar baixos níveis de fluorescência em uma exposição mais longa. Esses recursos tornam o SilVIR um detector inovador para formação de imagens de fluorescência de precisão.

No microscópio confocal a laser FV4000, a intensidade no eixo horizontal da Figura 13 pode ser convertida no número de fótons detectados e exibida na imagem como alternativa ao valor da intensidade. O número de fótons pode ser convertido a partir da largura entre os picos em forma de pente porque os picos estão em intervalos iguais. Especificamente, o detector SilVIR foi projetado para produzir 32 contagens ao detectar um fóton, enquanto um fóton equivale a uma contagem na contagem de fótons tradicional. Pelo nosso método, uma imagem adquirida pode ter um certo grau de gradação mesmo quando o número de fótons detectados é pequeno. Por este motivo, acumulando ou calculando a média de imagens com baixo número de fótons, podemos melhorar a relação S/R, evitando que as informações do número de fótons sejam enterradas no ruído ou nos erros.

_{Figura 13. Imagem fluorescente adquirida pelo SilVIR FV4000 e seu histograma de intensidade de pixel. O histograma mostra a distribuição de frequência em forma de pente para detecção de fótons discretamente.}
 

5. Imagens de exemplo do detector SilVIR

Esta seção apresenta imagens de LSM capturadas usando o detector SilVIR.

Comparação com imagens capturadas usando um PMT GaAsP

A Figura 14 mostra imagens de fluorescência verde capturadas pelos detectores SilVIR e de PMT GaAsP. A amostra foi excitada pela mesma potência do laser para atingir a intensidade típica de fluorescência. Quando a intensidade é relativamente forte, cerca de 128 fótons, ambas as imagens têm qualidade de imagem semelhante, mas o detector SilVIR tem uma contagem direta de fótons.

_{Figura 14. Ambos os detectores SilVIR e de PMT GaAsP podem adquirir uma imagem de amostra clara com uma relação sinal/ruído equivalente. A Figura 14(a) foi adquirida usando o detector SilVIR enquanto a 14(b) foi adquirida pelo PMT a 550 V. A mesma amostra foi excitada usando a mesma potência do laser. A intensidade máxima de fluorescência é de cerca de 128 fótons/2 µs.}

_{Escâner: escâner galvanômetro, 2 µs/pixel
Excitação: laser de 488 nm
Emissão: 500 – 540 nm
Filamentos de actina (BODIPY FL) da célula BPAE}

Entretanto, o mesmo não acontece com a fluorescência fraca. A Figura 15 mostra a mesma amostra com fluorescência fraca, cerca de 12 fótons, capturada usando os dois detectores. Você pode ver que as imagens capturadas usando o detector SilVIR apresentam menos ruído do que as capturadas com o PMT GaAsP convencional. Além disso, o histograma de intensidade da imagem do SilVIR é semelhante a um pente, indicando que o número de fótons foi detectado com precisão em cada pixel. Por outro lado, o histograma de intensidade da imagem do PMT GaAsP mostra que a intensidade da imagem é aleatória, o que resulta em uma falta de quantificação de fótons. Além disso, a alta tensão precisa ser ajustada de acordo com a intensidade da fluorescência a ser detectada para o PMT GaAsP, mas não para o detector SilVIR.

_{Figura 15. Esta figura mostra uma amostra com fluorescência muito fraca capturada (15a) pelo detector SilVIR e por um (15b) PMT GaAsP a 700 V. A mesma amostra foi excitada pela mesma potência do laser. A intensidade máxima de fluorescência é de cerca de 12 fótons/2 µs. O histograma de intensidade da imagem capturada usando o detector SilVIR mostra uma estrutura em forma de pente, que indica o número de fótons detectados com precisão. Mais ruído foi observado no fundo da imagem adquirida usando o PMT.}

_{Escâner: escâner galvanômetro, 2 µs/pixel
Excitação: laser de 488 nm
Emissão: 500 – 540 nm
Microtúbulos (Alexa Fluor 488) da célula PtK2}

Imagens de sinal/ruído alto de escâneres ressonantes usando um detector SilVIR

O detector SilVIR é adequado para formação de imagens de fluorescência de baixa intensidade. Em particular, ao adquirir imagens usando um escâner ressonante, é difícil adquirir imagens com uma relação S/R alta porque o número de fótons detectados é muito pequeno devido ao tempo de permanência de pixel extremamente curto. O detector SilVIR supera isso. A Figura 16 é uma imagem capturada com um escâner ressonante de 1024 × 1024 pixels. Imagens com um número diferente de acúmulos são alinhadas. Mesmo que o número de fótons detectados seja de vários níveis de fótons, uma imagem de escâner ressonante com boa qualidade de imagem pode ser obtida e um pequeno número de acúmulos (ou média) pode processar a imagem de escâner ressonante para ter qualidade equivalente à imagem de escâner galvanômetro. Isso também aumenta a eficiência de aquisição de imagens.

_{Figura 16. Imagens adquiridas usando o detector SilVIR e um escâner ressonante de 1K. A Figura 16(a) não mostra nenhuma média em 130 ms/frame, a 16(b) mostra duas vezes uma média de 262 ms/frame e a 16(c) é quatro vezes uma média de 522 ms/frame. Como o detector SilVIR pode adquirir imagens de relação sinal/ruído alta usando um escâner ressonante, a pequena quantidade de média é suficiente para obter uma imagem de alta qualidade. Isso melhora a eficiência da aquisição de imagem.}

_{Escâner ressonante: 1024 × 1024 pixels unidirecionais, tempo de permanência dos pixels: 0,033 µs
Intensidade máxima de fluorescência: cerca de 20 fótons.}

Adquira imagens montadas com eficiência usando o detector SilVIR

Para adquirir uma imagem de área ampla e de alta resolução, a imagem mostrada é frequentemente usada. Esse processo é lento usando um escâner galvanômetro, mas usar o detector SilVIR emparelhado com um escâner ressonante torna esse processo muito mais eficiente. Na Figura 17, as imagens de quatro canais, 1K × 1K pixels, foram adquiridas em oito fatias Z em um campo de mosaico 5 × 5. Usando um escâner galvanômetro, a captura da imagem demorou mais de 30 minutos, enquanto usando um escâner ressonante demorou menos de 6 minutos.

_{Figura 17. Aquisição de imagem eficiente usando o detector SilVIR. Uma projeção de intensidade máxima de imagens de fatia Z montadas foi adquirida usando um escâner ressonante. Devido à relação S/R alta do detector SilVIR, um grande número de imagens pode ser adquirido com eficiência.}

Aquisição de imagens de alta variação dinâmica usando o detector SilVIR

A variação dinâmica é limitada na formação de imagem do PMT convencional; se a amostra tiver uma mistura de objetos escuros e claros, um deles deve ser priorizado. Por exemplo, na Figura 18, ao adquirir uma imagem de neurônios, a saturação de intensidade no corpo celular era inevitável para adquirir imagens nítidas da estrutura da fibra neural com fluorescência fraca. O detector SilVIR pode adquirir áreas claras e escuras sem saturação graças à sua variação dinâmica de 16 bits.

_{Figura 18. Formação de imagem de alta variação dinâmica usando o detector SilVIR. A Figura 18(a) mostra uma imagem convencional onde algum corpo celular mais claro ficou facilmente saturado, enquanto 18(b) mostra uma imagem capturada usando o detector SilVIR onde tanto o corpo celular quanto as fibras neurais estavam no intervalo de detecção. Fibras neurais escuras foram aprimoradas ajustando a exibição gama.}

Formação de imagem multicolorida com o detector SilVIR

Aproveitando a alta sensibilidade e a relação S/R do detector SilVIR, desde o visível até o infravermelho próximo, é possível formar imagens simultâneas de seis cores, evitando os efeitos de diafonia (Figura 16). Corantes fluorescentes excitados por 730 nm dificilmente podem ser projetados usando um detector de PMT GaAsP, mas o detector SilVIR pode adquirir imagens de relação S/R alta. O microscópio confocal FV4000 pode ser equipado com um detector de até seis canais, permitindo a formação de imagens simultâneas de seis cores com uma resolução espectral com precisão nanométrica, atingindo de 400 a 900 nm.

_{Figura 19. Uma imagem simultânea de seis cores capturada usando o detector SilVIR e a tecnologia TruSpectral. É possível formar imagens multicoloridas simultâneas desde o visível até o infravermelho próximo.}

6. Conclusão

Ao comparar com os detectores convencionais, o detector SilVIR oferece muitos benefícios, incluindo:

• Formação de imagens multicoloridas com alta sensibilidade e relação S/R alta desde a faixa do comprimento de onda visível até a do infravermelho próximo.
• Alta resolução de detecção de fótons (contagem de fótons de alta velocidade e alta variação dinâmica).
• Alta reprodutibilidade experimental baseada na quantificação do brilho da imagem sem degradação da sensibilidade.
• Operação simples, eliminando a necessidade de ajustar o ganho como acontece com um PMT.

Esses benefícios facilitam a obtenção de imagens de alta velocidade e alta resolução com S/R alto, ao mesmo tempo que reduzem a fototoxicidade. Além disso, como o brilho da imagem pode ser quantificado como o número de fótons, as condições de formação de imagens de compartilhamento e reprodução são mais fáceis.

Além disso, os sensores SiPM têm grande potencial para desenvolvimento tecnológico futuro. Por exemplo, FF, que é um dos parâmetros que determinam o PDE, pode ser bastante melhorado se a matriz de microlentes em desenvolvimento para os próximos sensores de arranjo de diodo de avalanche de fóton único (SPAD) e técnicas de compartilhamento de anel de guarda [6] puderem ser implantados com sucesso. Se o PDE puder ser aumentado, será mais fácil equilibrar as trocas complexas entre a relação S/R, variação dinâmica, velocidade e contagem de pixels.

Acreditamos que o detector SilVIR pode se tornar o padrão para microscópios de escaneamento a laser da próxima geração devido ao quão bem ele superou os desafios associados aos detectores convencionais e ao seu potencial para continuar o rápido desenvolvimento no futuro.
 

7. Referências

1. Hamamatsu Photonics “Photomultiplier Tubes: Basics and Applications 4th Edition” (Hamamatsu Photonics, 2017).
2. Hamamatsu Photonics “MPPC®” Cat. No. KAPD9005E04 (Hamamatsu Photonics, 2022).
3. J. Zheng, et al. “Dynamic-quenching of a single-photon avalanche photodetector using an adaptive resistive switch” Nat. Communications 13, Article number 1517 (2022).
4. J. Friedrich, P. Zhou, L. Paninski “Fast online deconvolution of calcium imaging data” PLoS Comput. Biol. 13(3): e1005423 (2017).
5. Evident corporation, US Patent No. US11237047B2
6. K. Morimoto, E. Charbon “High fill-factor miniaturized SPAD arrays with a guard-ring-sharing technique” Opt. Express 28(9/27), 13068–13080 (2020).
    

8. Explicação dos termos técnicos

Efeito fotoelétrico externo: quando um metal ou semicondutor é exposto à luz, os elétrons no metal ou semicondutor saltam para o exterior (espaço de vácuo) devido à energia da luz.
Efeito fotoelétrico interno: um fenômeno em que um semicondutor ou isolante é irradiado com luz; ele aumenta a condução de elétrons no interior do material e a condutividade elétrica causada por este fenômeno aumenta.
Modo Geiger: a condição em que um fotodiodo de avalanche (APD) opera por tensão aplicada que causa a descarga de Geiger.
Tensão de ruptura: quando uma determinada tensão ou mais é aplicada a um APD, um determinado nível de saída de sinal inerente ao elemento receptor de luz é gerado (descarga de Geiger) por incidência de luz, independentemente da quantidade de luz. A tensão de ruptura é a tensão mínima aplicada que causa isso.
Ruído de contagem escura: ruído quando a luz não é incidente.
Ruído de diafonia: ruído pulsado gerado por vazamento de fotoelétrons de pixels do SiPM vizinho.
Ruído pós-pulso: ruído de pulso atrasado em resposta ao pulso de detecção de fótons originais.
Detecção de contagem de fótons de modelo paralisado: detecção de contagem de fótons únicos quando um pulso não pode ser separado quando os pulsos de detecção de fótons são sobrepostos continuamente. Exemplo: contagem de fótons usando um PMT.
Detecção de contagem de fótons de modelo não paralisado: detecção de contagem de fótons únicos quando os pulsos de detecção de fótons se sobrepõem, mas o sinal é emitido em intervalos de resolução de pares de pulsos. Isto equivale a usar um SiPM como um detector.
Resolução de pares de pulsos: intervalo de tempo mínimo no qual pulsos de detecção de fótons podem ser separados na detecção de contagem de fótons únicos.

Autor

Hirokazu Kubo
Tecnologia Avançada, P&D, Evident Corporation