Os microscópios confocais de varredura a laser são ferramentas de pesquisa biológica populares. Eles são geralmente usados para adquirir imagens imediatas de diversos fluoróforos com boa separação de cor, bem como para adquirir imagens dentro de um espécime biológico com capacidades de segmentação aprimoradas.

Atualmente, as mais recentes inovações em tecnologia de laser podem beneficiar aplicações como estas e propiciar experimentos mais avançados. Nesta postagem do blog, discutiremos sobre como os novos lasers de excitação de infravermelho próximo (NIR) nos nossos microscópios confocais FV4000 estão impulsionando aplicações de multiplexagem avançadas.*

Multiplexagem com mais de 5 canais em microscopia confocal – Superando desafios técnicos com o sistema FV4000

Vamos começar por esclarecer a história dos experimentos de multiplexagem.
Durante anos, muitos pesquisadores realizaram imunofluorescência com DAPI e duas outras cores, geralmente nos espectros verde e vermelho.

Com o avanço dos anticorpos e dos sistemas de formação de imagem através de mais detectores e melhor filtragem do comprimento de onda da emissão, a imunofluorescência de quatro cores se tornou popular. A combinação de DAPI, verde, vermelho e vermelho distante em uma imagem era a combinação de quatro cores mais comum.

No entanto, havia dois fatores críticos que impediam a introdução de um quinto ou sexto canal para multiplexagem:

1. A falta de díodos laser NIR com boas qualidades de feixe

Primeiro, díodos laser NIR com boas qualidades de feixe para microscópios de varredura confocal a laser não estavam amplamente disponíveis. Energia adequada (mas não excessiva), flutuação mínima de energia e perfis de feixe compatíveis são recursos necessários para díodos laser usados na formação de imagens confocais. No entanto, até recentemente, apenas algumas poucas opções de díodos laser NIR estavam disponíveis nesses intervalos de comprimento de onda.

Mas tudo isso mudou graças à mais recente tecnologia de díodo laser. Agora, o nosso microscópio confocal FV4000 oferece díodos laser de 685 nm, 730 nm e 785 nm para a excitação eficiente de corantes secundários, como os apresentados na tabela abaixo.

Estes corantes, junto com um número crescente de novos fluoróforos, estão tornando mais apelativa a adição de um quinto e sexto canal simultâneos para multiplexagem.

2. Tubos fotomultiplicadores com sensibilidade reduzida em comprimentos de onda NIR

Um segundo desafio para alcançar a formação de imagem NIR eficiente era o fato de que tubos fotomultiplicadores (PMTs), que têm sido usados como detectores padrão para microscópios confocais de varredura a laser, têm sensibilidade reduzida nos comprimentos de onda de detecção típicos para a região de comprimento de onda NIR (acima de 750 nm).

Esta sensibilidade reduzida nos intervalos de detecção de infravermelho próximo é especialmente verdadeira para PMTs GaAsP populares que oferecem maior sensibilidade no meio do espectro visível. Os detectores de GaAsP possuem baixíssima sensibilidade no intervalo acima de 750 nm.

Para superar esse desafio, implementamos a tecnologia de detecção SilVIR em nosso microscópio a laser confocal FV4000. Nosso detector SilVIR utiliza um fotomultiplicador de silício (SiPM), que é um sensor semicondutor que permite a aquisição de imagem de fluorescência com alta relação sinal-ruído de forma espectral em um amplo intervalo de comprimento de onda – de 400 nm a 900 nm.

Graças a essa tecnologia, nosso sistema FV4000 oferece um detector SilVIR de até 6 canais para aplicações de multiplexagem. Em combinação com as nossas objetivas de alto desempenho X Line™, o sistema FLUOVEW™ FV4000 pode fornecer ampla correção de aberração cromática de alta qualidade, de 400 a 1000 nm. A combinação de detectores SilVIR e objetivas X-Line™ resulta em uma credibilidade muito maior na formação de imagens de fluorescência multiplexadas e na formação de imagens NIR no geral.

*Este artigo foi atualizado com base no conteúdo original publicado em 21 de janeiro de 2020.
 

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