使用孵化监测系统对多点校准进行验证

简介

在日常细胞培养过程中，操作人员需要花费大量的时间和精力来正确维护和控制培养条件。要在传统细胞培养工作流程中正确管理细胞，操作员必须将细胞从培养箱中取出，并通过在显微镜下观察和计算细胞计数和融合率，检查细胞在一段时间内的状况。

此外，细胞质量必须在制备阶段保持稳定，以提高实验的一致性和可重复性。然而，操作质量会因操作人员的技术水平和其他因素而出现差异。细胞培养是生命科学和医学研究的起点，因此细胞质量对后续实验有重大影响。因此，必须在一定的培养条件下妥善维护和管理细胞质量。

我们的CM30孵化监测系统可全年365天、每天24小时从培养箱内部自动远程监控细胞培养条件，从而简化了这一过程。它还能根据基于人工智能的分析结果定期直观显示细胞状况。通过连续和标准化的测量，CM30系统使操作员能够高效、可重复地量化细胞状态，而无需依赖自己的直觉。
 

通过多点观测估计整个容器的细胞状态

为保持细胞质量，操作员必须每天观察并妥善管理细胞状况。以往，操作员要花费大量时间和精力使用显微镜观察整个容器，以了解细胞状况以及传代和收集的适当时机。此时，即使是稍微熟练的操作员也需要检查容器内的观察视野和整个培养容器，因为细胞的接种状态可能会因处理的细胞类型、容器和操作方法而不均匀。

因此，CM30系统可以每天自动对整个容器成像一次，然后对任意指定的观测点重复成像，使照相机在定期获取整个培养容器信息的同时，继续对所需的观察位置成像。

然而，在培养过程中的每个时间点收集整个容器的信息涉及硬件和软件方面的各种风险。例如，由于采集时间长、数据量大，数据处理比较复杂。此外，由于监测系统长时间运行，培养箱内的温度会升高，必须考虑这些环境变化对细胞的影响。

为了同时实现数据的可靠性和避免这些风险，CM30系统根据每个时间点的容器大小，在多个时间点（图 1）对细胞数量进行计数，然后根据分析结果的平均值估算整个容器的培养状态。这样，CM30系统就能有效获取定量数据，与实际培养条件的误差很小。

在本文中，我们介绍了CM30系统的定量数据采集、比较和验证结果*，以证实从多个点估算整个容器的细胞状态的有效性。

*本文介绍了Evident的内部验证结果。

图 1.不同细胞培养容器中的多点观测点数量。
 

细胞计数估计值的比较验证

使用以下细胞类型和培养容器进行验证，以比较细胞计数的分析结果。

细胞类型、培养容器（多点观测点数量）

• A549，12孔板（每孔9点）
• NHEK，T75烧瓶（25点）

具体来说，在同一时间点，对整个容器和CM30系统中为每个容器定义的多个观测点应用相同的分析参数，并比较细胞计数结果。为了比较整个细胞增殖过程的结果，我们还分别验证了三种细胞密度的结果：低、中、高。

CM30系统多点观测的有效性是通过比较两种方式估算的细胞数来验证的：一种是根据为每个容器定义的多点分析的细胞数平均值来估算整个容器的细胞数，另一种是通过直接观测整个容器来估算的细胞数，后者被视为上述三种细胞密度估算方法的真实参考值。

为了验证仅从一个观测点估算整个容器的细胞数的变化程度，我们将通过整体观测获得的一个观测点的最大和最小细胞数来估算整个容器的细胞数，并将这一估算值与整个容器的实际细胞数（即真实值）进行了比较。
 

使用孵化监测系统进行多点观测的相关性

下图2显示了整个容器的计数估计值（真实值）与12孔板和T75烧瓶中多点观测所得计数估计值的比较。

图 2.整个容器细胞计数估计值与多点观测细胞计数估计值之间的误差。

通常情况下，细胞计数和融合度分析是在细胞制备过程中进行的质量检验，准确度为真实值的±10%。在本次验证中，对于12孔板和T75烧瓶，在整个生长过程中，整个容器与基于多点观察的估计值之间的误差在±2% 以内。

因此，我们发现对每个容器进行多点观测所获得的估计值可提供足够可靠的数据，而无需观测整个容器。即使在条件苛刻的情况下，如12孔板，每个容器区域的观测点数量较少，在整个生长过程中，整个容器的估计值误差也在±2%以内。因此，CM30系统的多点观测数量足以估计整个容器的细胞状况。

除了对多点观测进行验证外，我们还检验了同一方法，即仅在一个容器的一个观测点上统计细胞数，并根据结果估算整个容器的细胞状况（图 2）。我们发现，12孔板的计数误差最高可达60%，而T75烧瓶的计数误差最高可达129%。

为了验证这一结果是否由于细胞接种不均匀造成的，我们使用了T75烧瓶中各容器细胞计数变化程度的热图（图 3）。黄色表示细胞数比总体平均细胞数多25%以上的细胞区域，浅蓝色表示细胞数少于25%的区域。红线表示CM30多点观测区域（T75烧瓶），橙色表示检测到最多细胞的区域，蓝色表示检测到最少细胞的区域。

验证结果表明，即使是经常进行细胞培养的具有一定熟练度的操作员，也会在部分操作中出现这种接种差异。这也表明，如果单个观测点所在的区域偏离整个容器的平均细胞数，则整体估算的风险非常高。

图 3.T75烧瓶细胞计数变化程度热图。

如上图所示，由于接种的不规则性会以一定的速度发生，因此从单一观测点估算整个容器的细胞状态具有很高的风险，即使操作员的细胞培养操作没有重大问题，得到的结果也很可能与实际细胞数大相径庭。这说明很难从单个观测点获得具有高度可重复性的定量数据。例如，在使用仅限于单个观测点的监测设备时，有必要通过每次移动容器位置来观测多个点，以量化整个容器的细胞状态。
 

结论

我们对CM30系统的比较验证表明，可以在不观察整个容器的情况下，根据多个点的细胞计数平均值估算出接近整个容器实际细胞计数的定量数据。这证明了从多个点估算整个容器的有效性。此外，即使操作人员稍为熟练，也会出现一定数量的接种不规范情况，因此从单一观测点估算整个容器的细胞数，很有可能获得与实际细胞数相差很大的数据。

本研究结果表明，在CM30系统上通过多点观测获得的定量数据对于细胞质量控制是可靠的。这些估计值还表明，即使只是简单地检查细胞状况，也要考虑一定程度的接种不规则性，并进行多点观测。

除上述分析方法外，CM30系统还进行了更新来改进细胞计数、融合度和其他分析功能。通过对每个分析参数进行更详细的设置，人工智能分析的准确性也得到了提高。CM30系统通过定量监测培养条件，同时最大限度减少人为变异，注重效率和可重复性，是日常任务繁多的细胞培养过程的最佳解决方案。
 

作者

Masatoshi Dehari
生命科学研究解决方案全球市场部
Evident