基于深度学习技术的TruAI对超低曝光荧光细胞进行定量分析

引言

荧光标记是基于显微镜观察的现代细胞研究中的重要工具。但是，激发光下的高强度曝露会通过光化学过程直接或间接对细胞造成影响。不良实验条件可能会以光损伤或光毒性的方式对细胞活力产生明显影响。即使未观察到直接作用，强光照射也会影响细胞的自然行为，从而导致不良作用。

在长时间活细胞实验中，最好能以最小的光曝露进行荧光观察。但是，较低的曝光会导致荧光信号较弱，通常会降低信噪比（SNR）。这会让定量图像分析难度增加（图1）。

图1
不同光照水平的图像。

图2
从左到右：具有最佳照度（100％）、较低照度（2％）、极低照度（0.2％）和超低照度（0.05％）的HeLa细胞DAPI染色核。由于信号水平降低到相机噪声水平，甚至达到相机的检测阈值，因此信噪比大幅度降低。对比度的优化依据可视信噪比进行。

TruAI背后的技术

从技术角度来看，分析超低曝光细胞的根本问题是图像的信噪比极低（图2）。为解决这一问题并获得低信号图像分析的鲁棒性和精确度，奥林巴斯TruAI将基于深度神经网络图像分析方法集成到cellSens成像软件和ScanR系统中。这种神经网络架构最近被称为最强大的对象分割技术。

这种能够轻松驾驭各种挑战性图像分析任务的神经网络成为具有超低曝光细胞精确定量分析的最佳选择。在训练阶段，神经网络能自动学习如何预测诸如细胞定位、轮廓和区室等相应参数，这一过程称为感兴趣对象的分割。

在训练过程中，为神经网络输入成对的示例图像和“基本事实”数据（即，经过标注的感兴趣区域）。神经网络经过训练之后，就可以将其应用于新图像并获得高精度的预测对象蒙版。

通常来说，在机器学习中，区域的标注（如，细胞边界）是由人类专家完成的。这个步骤可能非常乏味并且耗费时间，这是因为神经网络需要大量训练数据才能充分发挥其潜力。为了克服这些困难，cellSens软件提供了方便使用的训练标记界面。

另一方面，作为一种更简单的方法，显微镜通过在训练阶段获取参考图像自动生成训练神经网络所需的基本事实。

例如，若要训练神经网络对超低曝光图像中的细胞核进行鲁棒检测和分割，显微镜会自动采集大量成对的图像，成对图像中其中一幅为最佳照明条件下拍摄的，而另一幅是在曝光不足的条件下拍摄的。这些成对图像用于训练神经网络从而正确分析超低曝光水平生成的图像。

因为这种生成基本事实的方法几乎不需要人工干预，因此可以在短时间内获取大量训练用图像对。经过大量的训练，神经网络可以学会适应变化，其中包括不同信噪比水平以及图像照明不均匀性 ，这将会让学习后的神经网络模型不再受这些问题的影响。

低信号分割训练

为了训练神经网络在不同的信噪比条件下稳定检测细胞核，系统被设置为采集每孔板3×3位置的整个96孔板。每个位置均采集以下图像：

• 具有100％照度最佳信噪比的DAPI图像（200 ms的曝光时间和100％的LED激发光强度）
• 具有2％照度的DAPI图像（4 ms的曝光时间和100％的LED激发光强度）
• 具有0.2％照度的DAPI图像（4 ms的曝光时间和10％的LED激发光强度）
• 具有0.05％照度的DAPI图像（4 ms的曝光时间和2.5％的LED激发光强度）

该系统使用90孔位进行训练，不包括供后续验证使用的剩余6孔位。使用最佳信噪比和标准图像分析方法在DAPI图像中检测细胞核的位置和轮廓。分割蒙版与具有较低信噪比的图像同时用于训练，如图3所示。训练在安装NVIDIA GeForce GTX 1070 GPU的PC上花费了大约2小时40分钟。训练后，神经网络可以检测任何曝光时间的细胞核。
 

图3
训练神经网络。具有较高和次优信噪比的成对图像被用于训练任何信噪比条件下的神经网络对象检测。
 

应用低信号分割

按照图4所示的工作流程，现在可以将经过训练的神经网络应用于具有不同信噪比的新图像。您可在图5中看到不同信噪比的检测结果轮廓。

图4
应用经过训练的神经网络（推断）。该网络经过训练可以预测包括非常低信噪比图像在内各种条件下的对象位置和曲线。
 

图5
光曝露水平分别为100％、2％、0.2％和0.05％情况下通过TruAI在不同信噪比图像中检测对象的示例。对比度的优化依据可视信噪比进行。
 

不同信噪比分割结果的直接比较（图6）和不同信噪比轮廓叠加图清晰表明神经网络在较低曝光水平条件下的检测能力（图7）。除了最低光曝露（蓝色轮廓）外，从图像推断出的轮廓几乎完全重叠（红色，黄色，蓝绿色）。其表明使用神经网络进行鲁棒检测的极限在0.2％和0.05％光曝露之间。

图6
TruAI针对以100％、2％、0.2％和0.05％（从左上到右下）曝光水平采集的不同信噪比图像进行细胞核分割的结果。从最低信噪比（右下角）得出的轮廓与正确轮廓存在很大差异，其表明在超低曝露水平下进行定量分析的技术极限通常在0.2％至0.05％光曝露之间。对比度的优化依据可视信噪比进行。

图7
TruAI在以（0.05％）位最低曝光水平的4种不同信噪比情况下检测到的细胞核轮廓。为了更好地观察图像对对比度进行优化。

结果验证

为验证TruAI结果并确定定量分析的极限，对每种照度条件下两个孔板图像进行了分析。确定细胞核的定位和轮廓，对核进行计数，并测量核面积和DAPI信号的平均强度。scanR系统的高内涵筛选软件可分析细胞核种群的相关结果。最佳条件下的结果（图8，左上方）显示为两个不同的种群，与细胞周期的G1（单DNA含量）和G2期（双DNA含量）相关。

当仅以2％曝光分析图像时，动态范围会大幅度减小（图8，右上）。但在对图进行缩放后，可以看到相同的差异种群，所有曝光水平的相似分布在表1中列出。即使将相同的方法应用于以0.2％曝光的图像，G1和G2期的细胞计数和细胞值也几乎相同。

在最低曝光水平（0.05％）下，动态范围会进一步减小。在这种情况下，差异种群不再清晰可见（图8，右下），其结果细胞计数被低估约4％，而G2中的细胞百分比被高估约1％。这显示出在需要高精度测量时，实现成功分析的信噪比极限。尽管如此，这种超低曝光的检测结果也可以用于粗略估算。

图8
scanR散点图：从具有最佳信噪比（100％曝光）和较低信噪比（分别为2％、0.2％和0.05％曝光）图像得出的细胞周期图。注意y轴的不同缩放比例。

在不同曝光水平下得出的测量结果

结论

细胞核的荧光图像定量分析是生命科学研究多个领域的基本技术。使用TruAI进行自动检测既可以节省时间也可提高可重复性。但是，该方法必须稳定可靠，并且应该在荧光信号很弱情况下也可获得可靠的结果。

奥林巴斯TruAI能够在各种信噪比水平上进行可靠的细胞核检测。本文的结果表明，TruAI卷积神经网络可以用0.2％的常规照度要求获得可靠的结果。因此，在高难度光照条件下，新技术简化了针对大量图像的快速、稳定可靠的定量分析。大幅度减少曝光可以把对细胞活力的影响降到极低，并能够快速采集数据以及长期观察活细胞。

作者

Mike Woerdemann博士，
Matthias Genenger博士
产品经理
Olympus Soft Imaging Solutions GmbH
德国明斯特

* 1 [Long等人。2014: 完全卷积网络的语义分割]