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暗场显微观察是一种利用倾斜照明改善常规照明条件下成像质量不佳标本对比度的技术。
直射光被聚光镜内的不透明光阑阻挡后，从倾斜角度穿过样品的光线经过衍射、折射并反射到显微镜物镜内，形成叠加在深色背景上的明亮样品图像。
这种深色背景能够提供较高的对比度，并且轻松让背景效果不佳的标本更加突出。下面是一些图片示例。
右：蚕幼虫的气孔和气管。使用透射光显微镜在暗场条件下照明时，细微的碎木片会呈现出异常美丽的外观。
左：蝴蝶。由于该目成员的翅膀鳞片类型非常丰富，因此蝴蝶成为昆虫界最为色彩绚丽的成员之一。数字图像展示了装饰在蝴蝶翅膀大部分表面的众多细微鳞片。翅膀上的鳞片采用位于载物台下方的暗场聚光镜照明，图像以低倍率（50x）捕捉。
暗场显微观察的工作原理
暗场照明需要阻挡通常穿过样品和环绕样品周围的大部分光线，仅允许倾斜光线照射在样品上。
简易型阿贝暗场聚光镜的顶部透镜为球形凹面，其允许从顶部透镜表面发射的光线形成一个倒置空心圆锥体，并将焦点集中在样品平面上。在没有样品且聚光镜数值孔径大于物镜的地方，倾斜光线会相互交叉并错开物镜，从而让这些区域变暗。
将标本（尤其是未染色且不吸收光线的标本）放在载玻片上时，倾斜光线会与标本发生相互作用，并被诸如细胞膜、细胞核和内部细胞器等标本内部的要素所衍射、反射和/或折射。这些微弱的光线就会进入物镜。最终效果就是在黑色背景上呈现出明亮的标本图像。
暗场显微观察需要使用哪些组件？
几乎任何明场实验室用显微镜均可轻松转换用于暗场照明。最简单的方法是将您现有的聚光镜切换为专为暗场照明设计的聚光镜（图1）。
这类聚光镜相对简单，并具备产生暗场照明锥所需的高数值孔径（NA）。然而，对于日常显微镜的使用而言，根据照明类型切换聚光镜不切实际。幸运的是，并非没有解决方法。
很多聚光镜可以安装能够产生照明锥的插件。这些插件无法提供像专用暗场聚光镜一样较高的数值孔径，因此并非可以用于所有物镜。但插件让您能够在同一聚光镜上灵活采用多种观察方法。
图1.专门设计用于暗场照明的聚光镜
为什么暗场显微观察是一种很好的成像技术？
通常情况下，在适于暗场照明成像的观察对象看上去非常绚丽。在明场显微观察中本身对比度非常低的标本往往在暗场观察时非常耀眼夺目。
暗场照明特别适合显示轮廓、边缘、边界和折射率梯度。暗场照明的理想候选对象包括微小的水生生物、硅藻、小昆虫、骨、纤维、头发、未染色的细菌、酵母、组织培养细胞和原生动物。
适合暗场观察的非生物标本则包括矿物和化学晶体、胶体颗粒、粉尘计数标本、以及包含细小夹杂物、孔隙率差异或折射率梯度的聚合物和陶瓷薄片。
以下为使用暗场成像所捕捉标本的一些示例：
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左：这张绚丽的硅藻蛛网藻暗场显微图像由Mortimer Abramowitz使用奥林巴斯显微镜拍摄的样品使用高数值孔径暗场聚光镜照明，并在显微镜载玻片与物镜和聚光镜顶透镜之间放置浸油。 中：椴木。经过染色的标本通常是极佳的暗场显微观察对象，其所生成的图像在深色背景上呈现出绚丽色彩。该显微照片为在暗场照明下的椴木染色薄切片。 右：液晶DNA。这种高度浓缩的DNA溶液经历一系列液晶相变后，形成紧密堆积的六方相。该显微照片使用10倍物镜复合光学显微镜在暗场照明条件下拍摄而成。 |
遗憾的是，暗场照明对于显示内部细节的优势并不突出。如果想要充分利用暗场照明，还需要考虑其他条件。
使用暗场显微观察存在哪些挑战？
在制备用于暗场显微观察的标本时必须特别当心，原因是位于焦平面上方和下方的特征会散射光线并导致图像质量下降。载玻片的清洁度是影响成像的重要因素，在暗场照明中，由于细微碎屑均会被照亮，并且让你无法看清想要观察的部分，因此其重要性更甚。
设置暗场观察的显微镜时，可能面临的其他问题包括：
照明不足以让标本可供观察，或者可以观察标本但光线非常微弱。
由于很多光线被遮挡后形成锥形，暗场显微观察需要大量光线才能够正确成像。因此需要调高照明功率，但需要注意的是有些样品可能不能承受长时间大量光线照射。载玻片在视场中心有一个暗点，但外围观察对象则照明良好，看起来很正常。
这通常是由于聚光镜未正确对准或聚焦所造成的。将聚光镜居中并聚焦就可以解决这一问题。这种解决方法适用于大多数照明看起来不均匀但样品清晰可见的情况。背景中有颜色呈现，或由于背景存在灰阶导致不够均匀。
这通常是由于样品太厚或样品安装在受污染介质内造成的。重新安装样品应该就能够解决问题。
暗场显微观察有何优势？
暗场显微观察具有诸多优点。其深色的背景能够提供较高的对比度，即使在效果不佳的背景上也能够轻松观察标本。由于很多明场实验室用显微镜均可配置用于暗场照明，因此该技术很容易入手。除了显微观察的优势之外，在样品经过优雅照明的情况下，暗场图像可以看起来更像是一幅艺术作品。
