荧光显微镜是在现代生命科学研究领域使用广泛且功能强大的成像技术。荧光团通过特异性标记结合在靶标上，所发出的荧光信号能够提供极佳的成像对比度，甚至可以获得分子水平信号。
荧光显微镜能在生物学研究中成功，离不开高度发展的光学技术，和各种前沿的基因工程标记方法。
尽管取得了极大的成功，但对于荧光标记或分子的需求仍然限制了荧光显微镜的应用：
- 许多生物分子不具有荧光性，并且尺寸小，容易被荧光标记干扰
- 荧光团在活体中的表达水平和特异性可能会影响实验结果的准确性
- 使用外源性荧光标记不能直接适用于人体生物医学研究
考虑到这些局限性，使用荧光以外的具有对比度的光学成像方法就非常重要了。在本文中，我们将和您分享一种新型生物成像方法，希望能帮助您跳出荧光显微镜的限制并扩展您的研究潜能。
超越荧光显微镜的理念：
非线性光学能够利用特定分子的固有特性生成信号，从而无需荧光即可获得具有一定对比度的成像。
得益于先进激光光源技术和显微镜技术的问世，非线性光学已经不仅仅局限于实验室的精巧实验。它已成为生物成像的可行解决方案，并鼓舞研究人员思考超越荧光显微镜的显微技术。光谐波显微镜（optical harmonic generation (HG) microscopy）就是一个很好的例子。
二次谐波（SHG）和三次谐波（THG）显微镜
谐波是一种n个光子同时与材料相互作用并转换为一个光子的非线性光学过程。二次谐波（second harmonic generation，SHG，两个光子变成一个光子）和三次谐波（third harmonic generation ，THG，三个光子变成一个光子）是生物成像中最为常用的谐波显微镜。
下面的Jablonski能级图（图1）介绍了二次谐波（SHG）和三次谐波（THG）中的光子转换过程：二次谐波（SHG）产生的光子具有两倍于激发光子的光子能量（激发波长的1/2），而三次谐波（THG）产生的光子则具有三倍的光子能量（激发波长的1/3）。
图1：二次谐波（SHG）和三次谐波（THG）光学过程的Jablonski能级图。虚线表示虚拟态。
与多光子显微镜一样，二次谐波（SHG）和三次谐波（THG）需要利用超快脉冲激光源（通常在近红外波长范围内）在较小的激发焦点体积内实现非线性光学过程。因此，二次谐波（SHG）和三次谐波（THG）显微镜具有以下特点：
- 天然的光学切片能力
- 在高散射的组织中获得深度成像
- 较低的光漂白和光毒性
- 二次谐波（SHG）和三次谐波（THG）信号强度分别与激光激发功率的平方和立方成正比
但不同于多光子显微镜的是，二次谐波（SHG）和三次谐波（THG）信号来自于材料自身的结构和光学特性：
- 二次谐波显微镜通常用于非中心对称分子和有序结构成像，比如胶原纤维、微管、肌球蛋白、淀粉、皮肤组织和角膜基质。
三次谐波显微镜通常用于具有高折射率（与周围的水相比）的物质或界面的成像，比如细胞器、红细胞或白细胞、脂质滴、脂肪组织、轴突髓鞘和骨骼。
二次谐波（SHG）和三次谐波（THG）显微镜无需荧光团即可实现无标记的成像，并能够获得生物组织、活体的分子和结构信息，甚至可以用于医学成像诊断。
图2：使用奥林巴斯FVMPE-RS多光子显微镜获得的无标记猪脂肪组织二次谐波/三次谐波图像。二次谐波信号（青色）为胶原纤维，三次谐波信号（品红色）为脂肪组织中的脂肪。
图3：使用FVMPE-RS多光子系统采集到的斑马鱼胚胎中的血液流动图像。二次谐波信号（红色）为肌肉纤维。三次谐波信号（绿色）为红细胞。图片由慕尼黑工业大学Misgeld团队的P. Engerer提供。
既然已经介绍了二次谐波（SHG）和三次谐波（THG）显微镜的基础知识，那么下面将介绍帮助您将这些技术付诸实践的一些技巧。
配置二次谐波（SHG）和三次谐波（THG）显微镜的实用注意事项
由于二次谐波（SHG）和三次谐波（THG）显微镜可以与多光子显微镜共用近红外脉冲激光源和激光扫描单元，因此我们的FVMPE-RS多光子显微镜可以通过与二次谐波（SHG）和三次谐波（THG）显微镜的轻松结合打造多模态成像系统。
以下是设置二次谐波（SHG）和三次谐波（THG）显微镜时需要注意的两点：
- 前向检测和高灵敏度检测器：
虽然荧光发射通常是各向同性的，但是二次谐波（SHG）和三次谐波（THG）信号具有一定的方向性，这是在混波频率的过程引起的。大多数样本的前向信号（远离物镜）要比后向信号（朝向物镜）强得多。在这种情况下，高数值孔径聚光镜和透射式双光子NDD检测器是前向信号检测不错的选择。高散射组织中的某些前向信号可以反向散射，并可通过后向检测器进行检测。在这种情况下，可以使用高灵敏检测器，如磷砷化镓光电倍增管（GaAsP PMT）来优化您的后向检测效率，尤其是当前向信号检测不适用于大样本或活体动物的情况下。
- 在较长波长下具备良好的激光功率：
三次谐波信号需要良好的激光激发功率才能完成非线性光学过程，并且信号波长为激发波长的三分之一。为了在三次谐波显微镜中更好地传输和检测信号，可使用波长大于1200 nm且具有良好功率的激光源，从而让三次谐波信号能够落在可见光范围内。过去需要近红外脉冲激光器、光学参量振荡器（OPO）和经过专业培训的操作员才能够获得1200 nm以上的激光源。如今，随着激光技术的巨大进步，利用诸如Spectra-Physics InSight® X3等，使用成套超快脉冲激光器，就可以获得较长波长的大功率激光。
超越荧光显微镜，拓展您的研究潜能
我们配备先进显微镜技术和激光技术的FVMPE-RS多光子成像系统可以让您能够将多光子、二次谐波（SHG）和三次谐波（THG）显微镜完全集成在一个多模态成像平台中。借助这些强大功能，您就可以将研究的领域和范围扩展到荧光显微镜之外的领域，探索无限可能。
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