从Robert Hooke在自制透镜下首次观察到立方体形状的分裂细胞，到下村修对水母发光蛋白质和GFP的研究，再到庄小威在三维超分辨率重建过程中合成的闪烁染料分子，我们从未停止过使用光学显微镜探索生命的微观世界。
作为第四次工业革命的支柱，纳米技术工程在21世纪蓬勃发展，最初是在材料科学应用领域。当纳米技术与生命科学发生碰撞时，产生了新的火花—荧光纳米探针，自此，纳米材料的光照亮了生命的微观世界。
荧光显微镜的黎明
荧光是光致发光的一种类型，是由光的吸收引起的。自然界中存在着众多的荧光现象。从发光水母提取的绿色荧光蛋白（GFP）是这种现象在探索生物微观世界方面的首次实际应用。90年代初，研究人员发现，将GFP基因导入其他活生物体进行表达，会导致不能自然发出荧光的生物体产生绿色荧光。此后，科学家通过分析GFP的结构和机制，进一步改善了GFP的可用颜色、光强度、稳定性和其他特性，从而极大地促进了荧光蛋白（FP）在生物成像中的开发和应用（图1）。
图1.果蝇幼虫后肠的多色荧光成像，其中黄色标记纤维状肌动蛋白，绿色标记细胞核，强度度量查找表（LUT）标记脂滴
虽然荧光蛋白家族日益壮大，但其应用范围仍然有限。FP的发射光谱很宽且不对称，导致同步多通道成像中出现频繁串扰。借助与化学合成的碰撞，有机染料顺势而生，其品类丰富、操作简单，不但极大地扩展了荧光成像的应用范围，还方便进行标准商业化生产，为大规模发展奠定了扎实的基础。
纳米材料推动生物成像的进步
有机染料的某些缺点，如荧光效率低和光稳定性差，逐渐成为阻碍荧光成像技术发展的绊脚石。幸运的是，由于固有的特殊光学特性、定向合成和组装以及其他优点，纳米材料正在为荧光成像注入新的血液。目前，常见的荧光纳米材料包括以下几种（图2）：
- 半导体量子点（QD）
- 上转换稀土材料（上转换纳米颗粒，UCNP）
- 贵金属纳米颗粒
与其他染料相比，荧光纳米材料具有量子产率高、稳定性好、斯托克斯位移大、激发光谱宽、发射光谱窄等优点。其发射波长可以通过尺寸调整来改变。此外，其生物相容性、识别和传感功能可以通过组装和修饰来得到改善。总之，纳米材料为荧光标记和荧光成像的未来提供了很大潜力。
图2.有机和无机纳米颗粒的示例，描述其尺寸、形状和材料
荧光纳米探针基本工作流程
由于这是一个涉及纳米化学和生物成像的跨学科过程，因此荧光纳米探针工程的工作流程不同于传统的生物成像。这是一个多步骤的过程，包括理论计算、化学合成、生物成像，甚至医学测试（图3）。
图3.荧光纳米探针基本工作流程
荧光纳米探针的研究过程主要面向应用。荧光纳米探针的生物成像涵盖了从体外样品到体内动态成像等多个领域，甚至可以推进到医学诊断和研究。因此，在设计纳米探针时考虑了生物应用，并根据生物应用的具体需要选择具有特殊光学特性或其他功能（例如，近红外、上转换、双光子等）的纳米材料，然后合成并进行表征，以筛选出高质量的纳米材料。随后，再进一步考虑探针的生物相容性或光控、载药、分子识别等功能性的需求，对探针进行修饰组装（图4）。
图4.涂有绿色荧光蛋白（GFP）和柠檬酸分子的金纳米探针（GNP）的三维渲染
在设计荧光纳米探针的研究中，光学显微镜主要应用于三个领域：鉴定、筛选高品质纳米材料，以及纳米探针的体内检测。在筛选过程中，由于不同颗粒固有的结构不均匀性，其特性往往变化很大。与传统方法依赖大量颗粒集合的特性不同，光学显微镜能够在单个颗粒水平筛选高质量探针，并进一步研究其结构-功能关系，以指导其设计合成。在生物成像方面，光学显微镜能够在体内检测纳米探针的光信号，对其动态时空反应进行成像和跟踪。
荧光纳米探针和显微镜解决方案的研究应用
使用共聚焦显微镜解决方案进行近红外/上转换成像
由于穿透深度大、光毒性低、组织自体荧光干扰小等优点，近红外成像目前已成为光学显微镜的研究热点。而荧光纳米探针如量子点，可以通过调节其化学组成及形貌尺寸，轻松实现近红外激发。此外，上转换纳米材料具有特殊的光学特性，可用于近红外成像。当被长波长光（NIR）激发时，它们会发出比激发光的波长更短的光（可见光或紫外光）。由于这些优点，上转换纳米探针被认为是新一代荧光生物标记物，有望在生物医学、能源和催化研究等领域发挥重要作用。
在体肝毒性的灵敏实时检测是目前药物性肝损伤诊断的瓶颈所在。在Li Huijun教授的研究小组于2020年发表的一篇论文中，通过组装上转换纳米颗粒（UCNP）和金纳米棒（GNR），设计了一种上转换纳米探针，并应用于药物性肝损伤的原位实时诊断。这种新型纳米探针可以聚集在肝脏中，并由肝损伤标记物miR122特异性激活，在980 nm的近红外光激发下，在800 nm处产生荧光图像。结合发光共振能量转移（LRET）和信号放大技术，进一步提高了其检测灵敏度，实现了miR122的高灵敏度检测，为药物性肝损伤的实时临床监测提供了新的途径。[4]
与传统共聚焦成像不同，近红外/上转换纳米探针成像需要具有特定功能的设备：
- 常规共聚焦显微镜的激发波长大多在400-650 nm之间，而近红外成像需要>700 nm波长的近红外激光器
- 传统成像中使用的大多数光路组件，如扫描振镜、物镜和衍射光栅，仅支持可见范围内的减反射/校准，无法提供NIR的成像效率和精度
- 近红外检测需要专用的>750 nm近红外检测器
为了满足这些要求，FLUOVIEW FV4000激光共聚焦显微镜提供了近红外成像解决方案（图5）。FV4000系统专门用于拥有更多颜色的高度灵敏和准确的NIR成像。
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图5.模块化FLUOVIEW FV4000共聚焦激光器扫描系统可提供NIR成像解决方案 |
在与李凯博士（中国南方科技大学）合作编写的本应用说明 中，您可以了解关于成功使用FLUOVIEW NIR解决方案来确定NIR荧光分子、基于BTB的纳米颗粒对肿瘤细胞的靶向能力的信息。（图6）本研究中的研究人员使用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）靶向肽修饰BTB纳米探针的表面，并观察到小鼠在注射BTB-RGD NP的48小时后，肿瘤部位的NIR-II荧光信号相较于BTB纳米探针显著增加。
图6.用40 μg mL-1的BTB-RGD或BTB NP孵育4小时后FV3000 Red产生的3T3、PC3和U87细胞的共焦图像。
激发波长：730 nm，滤波器：760–890 nm，刻度尺 = 50 μm。
使用FLUOVIEW多光子显微镜深度检测解决方案对肿瘤标记物进行在体成像
癌症是社会上最严重的公共卫生问题之一。恶性肿瘤的早期诊断和准确切除是当前医学研究的首要任务。而通过设计开发新型荧光纳米探针，实现对肿瘤标记物的特异性识别、高分辨在体成像，可以为恶性肿瘤的早期临床诊断以及外科准确切除提供新的检测方案。
肿瘤细胞中碱性磷酸酶（ALP）等酶的过度表达是肿瘤发生、发展和恶化的重要临床指标。因此，对ALP活性高度敏感的快速检测方法有助于早期检测和准确切除肿瘤。2020年，彭孝军教授和他的团队发表了一篇关于纳米探针的使用的论文，该探针正是为此目的而设计的。本文详细介绍了他们如何设计和制备一种AIEgen探针（DQM-ALP），该探针与肿瘤细胞中过度表达的ALP相互作用后，在聚集时发出强荧光。这种工程纳米探针避免了传统有机染料聚集引起的荧光猝灭问题，从而提高了探针在肿瘤细胞中的检测灵敏度和保留时间。这项工作首次发现了丁酸钠和皮质醇刺激对肿瘤细胞中ALP活性的上调，他们使用双光子显微镜对HeLa和HepG-2肿瘤球体中的ALP活性进行了高空间分辨率三维深度成像。本文证明了该探针在亚毫米肿瘤荧光检测成像中的有用性，为肿瘤的临床诊断和手术切除提供了有力的支持工具。[5]
上述研究中使用了单光子和双光子共聚焦显微镜。然而，最新的FLUOVIEW多光子显微镜，其设计用于体内深部荧光成像，具有专有的高速共振扫描振镜和高度灵敏的光学检测路径，能够以更准确和高效的方式实现肿瘤标记物的高分辨率三维深部成像（图7）。
在Evident的多光子系统中，双线/双激光器和多达六个通道的高灵敏度检测相结合，支持更灵活的多色成像，进一步提高了检测通量和效率。
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图7.带有深度成像模块的FV4000MPE多光子系统 |
使用IXplore SpinSR快速超分辨率解决方案对活细胞中的纳米探针进行动态检测
活细胞中的生化反应和其他分子事件通常具有显著的时空动态特征。光学成像技术可以精确跟踪纳米探针的运动，并研究它们与生物分子的相互作用。它使研究人员能够有效监测这些生物标记物，观察动态变化，以进一步探索其状态与相关细胞功能之间的关系。内体、溶酶体和其他细胞器在信号转导和维持代谢稳态中起着关键作用。由于这些细胞器的pH值在内吞过程中会发生变化，因此对这些细胞器pH值的快速、灵敏检测已成为动态监测内吞过程和探索其状态与细胞功能之间关系的研究热点。
2016年，北京大学汪贻广教授和美国德克萨斯大学西南医学中心高金明教授的研究团队发表了一篇论文，他们设计了一种单细胞器分辨率的pH超敏感纳米探针（HyUPS）。他们使用这种纳米探针来跟踪和检测内吞过程中内体/溶酶体和其他细胞器的pH变化。该探针含有三种pH敏感的组分，对应内吞过程的三种组分及三个pH范围，并分别使用红绿蓝三种荧光团标记。该探针成功实现了活细胞内吞相关细胞器酸化速率的动态多色实时监测，为研究内体/溶酶体功能障碍疾病的进一步研究提供了新的成像工具。[6]
活体标本中的纳米探针成像需要高速成像设备，而传统的点扫描共聚焦方法无法满足要求。IXplore SpinSR转盘共聚焦超分辨率成像系统可以在超分辨率（110 nm）质量下实现快速（200 fps）多色成像（图8）。这些能力使其能够捕捉精细结构的快速动态过程，使其成为生命科学研究人员轻松提高成像效率的有力工具。专有的RTCe（实时控制器）可控制所有组件的同步操作，使激发光对样品的影响降到最低。这种优势，再加上为深层活检设计的硅油物镜，可以对活体细胞、球体和类器官样品进行长期、准确的深层成像。
如图9所示，IXplore SpinSR系统的超分辨率成像能力示例，显示了用PKMDR染料染色的上皮细胞线粒体。PKMDR是由北京大学的陈知行教授开发的，PKMDR是一种线粒体探针，在荧光和纳米成像中能够最大限度地减少光毒性。
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图8.IXplore SpinSR转盘共聚焦超分辨率成像系统 |
图9.使用IXplore
SpinSR系统、UPLAPO60XOHR物镜和TruSight处理，用PKMDR染料染色的上皮细胞线粒体的超分辨率图像。图像承蒙以下人士和机构提供：蒿慧文博士、杨俊生博士、孙育杰教授和陈知行教授Standard
Imaging Co., Ltd.北京大学未来技术学院孙育杰实验室。NanJing GenVivo Biotech Co.,Ltd.
近十几年来，随着纳米技术和光学成像技术的飞速发展，基于荧光纳米探针的生物化学成像应用已取得了许多重要进展。但是，荧光纳米探针在应用上仍然受制于其生物相容性、存在荧光闪烁行为等不足。随着纳米材料、生物成像技术、化学合成、理论物理、图像分析等学科的不断发展和融合，可望进一步提高荧光纳米探针生物成像的特异性、准确性、稳定性和重现性，拓展其潜力，使之在更多领域发挥更重要的作用。
*本文根据2022年10月6日发布的原文内容更新。
参考文献：
[2].Chang, H.,Xie, J.,Zhao, B.,Liu, B.,Xu, S.,Ren, N.,Xie, X.,Huang, L.,& Huang, W.(2014).Rare Earth Ion-Doped Upconversion Nanocrystals:Synthesis and Surface Modification.Nanomaterials (Basel, Switzerland), 5(1), 1–25.
[3].Chen, Z.,Wu, X.,Hu, S.,Hu, P.,& Liu, Y.Multicolor upconversion NaLuF4 fluorescent nanoprobe for plant cell imaging and detection of sodium fluorescein.J.Mater.Chem.C, 2015, 3, 153-161
