位于西班牙托莱多的Hospital Nacional de Parapléjicos医院（HNP）是西班牙国家脊髓损伤参考中心。HNP的目标是为脊髓损伤患者提供全面的健康和康复服务，培训合格人员，并在神经科学领域开展科学研究。
为了支持神经科学研究，HNP配备了用于显微镜和图像分析、流式细胞术、蛋白质组学、小动物核磁共振（NMR）和动物饲养的核心设施。用于显微镜和图像分析的设施包括一个强大的多模式解决方案，该解决方案使用一台显微镜来支持全载玻片扫描和高内涵筛选（HCS）。
该解决方案将IXplore Pro自动显微镜系统与scanR高内涵筛选软件*和cellSens成像软件相结合。其可以适应各种各样的应用和成像技术，包括使用TruAI深度学习技术的高级图像分析。
图1. 西班牙托莱多的Nacional de Parapléjicos医院的全景图。照片承蒙Juan Carlos Monroy提供。
Nacional de Parapléjicos医院的显微镜和图像分析设施由José Ángel Rodríguez Alfaro博士和Javier Mazarío博士管理。我们最近与他们进行了交谈，以了解他们在该设施的中央服务中使用IXplore Pro系统与scanR和cellSens软件的经验。
问：你们为什么考虑在设施中使用IXplore显微镜系统和scanR软件？
答：在我们的设施中，我们有各种光学显微镜，从自动激光扫描共聚焦显微镜到手动常规显微镜。我们以前有一个封闭式高内涵分析（HCA）系统，在运行了10年后坏了，我们需要一个替代品。
在这件事发生的时候，我们正在寻找将该系统获得的数据导出到流式细胞仪分析软件的方法，以便能够对我们的HCA系统获得的测量结果进行更精细的门控分析。
scanR系统引起我们注意的第一点是，软件中已经内置了这种细胞测量门控分析功能。我们没有发现任何其他可以进行此类分析的HCA系统。这是我们倾向于IXplore系统和scanR软件的关键因素之一。
问：你们喜欢这个系统的哪些其他功能？
答：我们喜欢它不是一个带有cellSens软件的封闭系统，我们还可以拥有一个能够扫描玻片的宽视野显微镜。这种二合一的系统配置对我们来说是非常合适的，因为这可以让我们扩充设施提供的各种服务。
该系统的模块化是非常方便的。得益于此，我们将能够在需要时添加更多功能，比如加入用于活细胞研究的培养箱。
另一个关键点是有可能将先进的人工智能图像分析技术（如TruAI）纳入我们的产品组合，该技术不仅适用于cellSens和scanR图像，还适用于其他显微镜系统获得的图像。
问：添加IXplore系统后，对您的设施有什么影响？有什么变化？
答：IXplore系统与scanR软件相结合已迅速成为我们设施中使用最多的显微镜。使用时间比以前的“明星”——共聚焦显微镜——多了一倍多。
尽管这是一台落射荧光显微镜，但图像的分辨率足以让研究人员考虑在某些研究中从共聚焦成像切换过来，特别是那些成像速度比Z轴精度更重要的应用需求。这使得它们能够采集到使用激光扫描共聚焦显微镜花费很长时间才能获取到的图像。
而且，重要的不仅仅是提高了速度，还可以使用4玻片支架结合聚焦地形图来建立实验，让实验可以在夜间无人照看的情况下进行。
与我们以前的HCA系统相比，在使用scanR软件获取数据的同时运行数据实时分析的可能性是另一个巨大的改进。图像采集完成后，我们即会得到分析结果，然后便转到下一个样品。
事实证明，TruAI的深度学习技术也是一个非常有用的工具。与标准分割技术相比，高密度细胞培养样品中的细胞核检测得到了极大的改善，使用户能够从他们的实验中获得更精确的数据。
问：您能举一个您的设施使用IXplore系统和cellSens软件的例子吗？研究人员希望在图像中看到什么？
答：很多时候，我们采集的是小鼠、大鼠，甚至猪的脊髓横向或水平切片的高分辨率图像，研究人员会在其中寻找胶质细胞群的变化、神经元的存活情况或脊髓损伤（SCI）后不同标记的表达情况，以及轴突在病变部位的生长。
但我们并不局限于脊髓组织。我们还对大脑切片进行高分辨率扫描。在这个例子中，我们用微分干涉对比法（DIC）扫描了小鼠大脑的整个切片，然后在其中寻找荧光报告基因mCherry的表达位置。
图2.使用DIC和荧光的小鼠大脑的全玻片图像。图片承蒙HNP的实验神经生理学和神经回路小组提供。14
图3.上一张图像中一个区域的特写。图片承蒙HNP的实验神经生理学和神经回路小组提供。18
问：您能举一个您的设施使用ScanR软件进行HCA的例子吗？研究人员希望在数据中看到什么？
答：HCA经常用于研究不同条件下的细胞增殖、分化和迁移。在我们的设施中，我们使用scanR软件进行的最频繁的检测之一是检测不同处理下报告基因（GFP和mCherry）的表达。我们使用TruAI对高密度细胞培养物中的细胞核进行分割，并与门控分析相结合，对群体中单标记和双标记细胞的数量进行量化，然后评估不同处理方法的效果。
我们还使用该系统检测血液和精子样品中的荧光原位杂交（FISH）。在这种情况下，我们不仅使用TruAI分割细胞核，还检测细胞核内的FISH点。
图4.scanR软件的主窗口显示细胞和细胞核的分割，周围是散点图和直方图。在二维散点图中，每个点代表一个分割的细胞。在一维直方图中，每条线代表一个参数值，线的高度与具有该值的细胞数量相对应。在第一个散点图中，门控（R01）根据细胞的大小和形状选择一个细胞亚群，并将其转移到以下分析图中。R01之外的细胞将被丢弃。在第二个和第三个分析图中，创建了绿色阳性细胞（R02）和红色阳性细胞（R03）的门控。在最后的分析图中，R01、R02和R03将会结合起来，以得到单一和双重阳性细胞的百分比。数据承蒙HNP的分子神经学小组提供。22
图5.scanR软件使您能够从门控区域创建图库。示例显示了细胞群的图库：双阴性、单阳性绿色、单阳性红色和双阳性绿色-红色。可以将结果导出到表格中，或者在孔板的背景下以热图的形式对结果进行可视化。数据承蒙HNP的分子神经学小组提供。
问：你们是否使用TruAI技术来开发自己的深度学习神经网络模型？
答：是的。我们已经为密布的细胞核的分割、脊髓切片中的神经元的探测、不同种类的肌肉纤维的分类、某些治疗后的异常细胞核的识别等训练了模型。
这是我们非常喜欢该软件的一点，那就是不仅可以运用由该系统获得的图像，还可以运用由非奥林巴斯显微镜获得的图像来轻松训练神经网络模型。而且，现在我们可以使用免费的可视化应用程序OlyVIA来标注图像，让这项工作变得更加方便，使得用户可以在自己的办公室甚至家里的电脑上完成这项工作。
图6.左图显示小鼠脊髓切片的神经元标记NeuN（绿色）。右图显示了同一切片以及显示了TruAI对NeuN阳性细胞（粉色）的探测的一个图层。图片承蒙HNP的分子神经保护小组提供。28
问：您最喜欢这个系统的哪一点？
答：正如我们之前提到的，这个系统有很多我们喜欢的地方。也许其中令人印象深刻的是，通过cellSens和scanR软件的结合，我们只用一个显微镜系统就可以实现从全玻片扫描到HCA。这种二合一的配置对于优化我们设施中的资源是非常有意义的。当然，还有TruAI，它与这两个系统完全兼容。它使我们能够在两个软件中使用神经网络模型，而且无需考虑使用哪个软件进行训练。
了解更多关于IXplore显微镜系统的信息
IXplore显微镜系列指的是为不同的生命科学研究应用而定制的倒置显微镜。IXplore Pro电动倒置显微镜包括明场、多通道荧光、Z堆叠和拼接功能。
IXplore系统由cellSens软件控制，该软件是奥林巴斯相机显微镜的平台，可以适应宽场显微技术的各种应用和成像技术。这包括常规显微镜、转盘共聚焦、超分辨率、全内反射荧光（TIRF）、荧光漂白后恢复（FRAP）等。
通过选定的硬件，同一台IXplore显微镜也可以用scanR软件进行控制，该软件专门为孔板和腔室载玻片中的高内涵筛选应用进行了精简设计。
受访者
感谢José Ángel Rodríguez Alfaro博士和Javier Mazarío博士，西班牙Nacional de Parapléjicos医院的显微镜和图像分析核心设施的管理人员，感谢他们在这次采访中分享他们的经验。有关该设施的任何问题，请给他们发送电子邮件：microscopia.hnp@sescam.jccm.es。
José Ángel Rodríguez Alfaro博士和Javier Mazarío博士，西班牙Nacional de Parapléjicos医院的显微镜和图像分析核心设施的管理人员。
*scanR系统不在日本提供。
