脱髓鞘后恢复7天的小鼠小脑组织切片。轴突用绿色的Neurofilament-H标记，髓鞘用红色的髓鞘碱性蛋白标记，GSTpi用蓝色的少突胶质细胞体标记。样本由科罗拉多大学丹佛分校硕士Katherine
Given提供。使用带有SILA模块的SLIDEVIEW VS200研究级全玻片扫描系统以20倍率拍摄。
宽视场荧光显微镜为薄型样品提供高分辨率成像。但对于较厚的样品，宽视场荧光显微镜的成像能力就会受到限制，因为背景荧光会导致图像模糊。
那么，如何消除较厚样品中的图像模糊呢？答案就在光学切片中。这种方法有效克服了宽视场成像的局限性，但以往其需要使用共聚焦系统或去模糊软件。
如今，光学切片技术已应用于研究级全玻片扫描系统。这意味着研究人员可以受益于共聚焦功能，对厚样品进行成像—同时显著提高通量。在此，我们将详细探讨这种光学切片方法的优势，并将其与传统技术进行比较。
厚样品的宽视场成像有哪些局限性？
宽视场显微镜是一种常见的成像技术，对薄样品（<10 µm）非常有效。在宽视场显微镜中，相机同时采集焦内和焦外平面的光线。这对于薄样品来说不是问题。在对较厚的样品进行成像时，这种不可避免的背景荧光会导致图像模糊和对比度不佳，从而遮盖了需要关注的结构。
共聚焦显微镜和其他扫描照明方法可以克服这一问题。其工作原理形成固定的照明模式来产生光学切片图像。这些系统在比较理想的条件下可以产生出色的图像。然而，此产生图像的成本很高。而且还依赖于向样本中投射定义明确且可控的照明模式。
采用不同的照明方法对厚样品进行成像
并非总是需要定义明确且可控的照明模式来消除背景荧光对图像对比度和质量的影响。一种称为HILO显微镜的技术使用随机斑点模式来照亮荧光样本。斑点模式能够表现出颗粒强度，具有固有的高对比度，使通过斑点照明获得的荧光图像呈现颗粒状。这种颗粒感具有对比效果，并直接显示样品的聚焦程度。
在HILO成像过程中，会收集和处理两幅原始图像。第一幅是均匀照明的常规宽视场图像。在该图像上应用高通滤波器来提取高频信息—即HILO显微技术的“HI”部分。此步骤可消除低频信息，包括焦内和焦外信息。
使用斑点照明拍摄第二幅图像，以恢复低频焦内图像信息。该信息即HILO显微技术的“LO”部分。这些图像经过算法处理，可提取焦内信息并消除背景荧光。然后将两幅图像融合在一起（图 1），以获取包含全频范围信息的图像，并去除焦外光线。
SILA光学层切设备是我们基于HILO显微技术的SLIDEVIEW VS200研究级全玻片扫描系统的高通量成像解决方案。这是一种用于宽视场显微镜的附加技术，可消除焦外光线。值得注意的是，它能产生与共聚焦显微镜相同的锐利光学切片。SILA设备可轻松添加到任何VS200系统中。它为一系列需要高质量厚样本光学成像的应用带来了益处。
图 1.小鼠肾脏切片（20倍放大率）。VS200扫描系统上的SILA设备将均匀照明图像与斑点照明图像相结合，生成具有清晰光学切片的组合图像。
仅用一个参数即可调整光学切片
由于SILA设备对传统的宽视场图像和斑点图像进行了数学处理，因此可以使用切片厚度 (ST) 这一个参数来调整光学切片的程度。当ST设置为高时，图像会显示更大景深的信息。这使图像看起来像宽视场图像。
图2显示采用ST5厚度拍摄的大脑切片。在这种高ST值下，仍存在许多焦外区域。随着ST值的降低，图像显示的景深信息也会变小。因此，在观察采用ST2和ST1厚度拍摄的大脑切片时，焦内信息仍然存在，而焦外元素则消失了。
通过这种方式优化光学切片的能力可以在去除背景荧光的同时实现不同深度的可视化。用于VS200扫描系统的SILA设备的这一功能可与共聚焦显微镜系统相媲美，在共聚焦显微镜系统中，改变针孔大小可达到类似的效果。
图 2.用tdTomato标记的小鼠大脑样本（20倍放大率）。
消除厚样本中的模糊：SILA成像对比其他技术
在开发SILA设备之前，VS200扫描系统有一种替代解决方案，可用于去除宽视场图像中的焦外光线。使用TruSight反卷积软件，可以使用二维约束迭代 (CI) 算法对图像进行反卷积。这种基于软件的方法可以很好地去除部分焦外光线。然而，它不能像SILA模块中使用的软件和硬件组合那样去除大量焦外光线，也不能提供光学切片优化。
然而，在无法使用SILA光学切片技术观察较薄样品的情况下，反卷积技术的确可以提供了一种可行的折中方案。有关传统宽视场图像、软件反卷积图像和SILA图像之间的图像质量差异见图3。
图 3.20倍放大率下的整只地中海平涡虫（Schmidtea
mediterranea），含肠道信息。蓝色：DAPI。绿色：内肠细胞。红色：外肠细胞。样本由德国哥廷根马克斯-普朗克研究所组织动力学和再生部的Amrutha
Palavalli提供。
SILA成像应用：从厚细胞层到组织样本
SILA光学切片技术可为许多研究应用创造重大价值，尤其是在固定厚细胞层和组织样本成像方面。SILA具有切片优化功能，以及与共聚焦显微镜相当的消除模糊和图像对比度功能，可提供高质量的成像，并大大提高通量。
能够对较厚的样品进行成像是神经科学成像的一大优势，因为在神经科学成像中，通常需要对较厚的组织切片进行成像，以保留样品的形态。众所周知，脑切片成像具有挑战性。由于脑组织容易产生光散射效应，因此其切片成像尤其困难。
传统上，需要共聚焦或双光子显微镜系统才能捕捉到高质量、高对比度的图像。然而，这些系统需要大量时间才能对大脑切片等大面积区域进行成像。带有SILA设备的VS200系统提供的自动玻片扫描功能可使大面积厚样本的成像速度大大加快。只需少量时间即可获得高质量图像（图 4）。
图4.200 μm小鼠脑切片。4倍放大率下的概览图。详细扫描是在20倍下采集的47 µm
Z系列的景深扩展图像（EFI）。蓝色：DAPI。绿色：GFAP（神经胶质）。黄色：MAP2（神经元）。
类器官研究是另一个受益于SILA成像技术的领域，因为类器官成像技术面临着与神经科学类似的挑战。由于样本较厚，对类器组织成像具有挑战性，同时需要对大面积进行成像，以便对类器组织形态进行正确分析。
作为全玻片扫描系统，带有SILA模块的VS200系统可提供对这些大样品进行成像所需的覆盖范围。同时，其自动图像处理、与样品无关的点扩散函数（PSF）和简单的工作流程可实现快速图像采集。SILA设备还能为癌症研究、空间生物学、植物学、胚胎学以及其他许多需要对厚样本进行大面积高质量成像的应用提供支持。
SILA成像主要特点
SILA成像可优化光学切片、减少样品模糊并提高图像对比度，其效果可媲美复杂的共聚焦激光扫描显微镜。与共聚焦系统相比，配备SILA设备的VS200全玻片扫描系统可大幅提高通量，可对传统上难以成像的大型样品进行快速成像，为神经科学、类器官研究等带来显著优势。
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