从天文学到显微镜：TruSpectral技术之旅

作者 Rebecca Bonfig - 2020年 11月 19日

共聚焦显微镜检测原理

激光扫描共聚焦显微镜是检测细胞和组织中蛋白质表达及相互作用的经典技术。与宽场落射荧光显微镜相比，共聚焦显微镜利用与焦平面共轭的针孔，极大地降低了焦平面外杂散光的干扰，从而获得组织焦平面光学切片图像。

共聚焦成像方法能够有效实现对厚样本的清晰、高分辨率成像，但是针孔的固有光损耗极大地降低了其图像的信噪比。因此，提高显微镜光学系统的光效率，并尽可能减少激光强度，同时尽可能检测到更多的发射光信号，是提高图像信噪比的关键所在。

滤色片和光谱检测技术的差异

早期的共聚焦显微镜只能使用简易滤色片检测荧光，通常情况下，需要将一个带通滤色镜放置在检测器光电倍增管（PMT）前，用以筛选进入检测器的光的波长。

随着技术的发展，新型共聚焦显微镜开始利用光栅或棱镜获得发射光的光谱，对一个或多个检测波段进行精确调节，实现“万能滤色片”的光谱检测功能。使用光谱检测，您还能对整个发射光谱实现特定带宽和步进的“光谱扫描”，获得标本发光谱曲线信息，并能特异性地去除背景自发荧光或拆分串色信号。

因此，基于光谱的检测方法极大地提高了实验的灵活性，成为共聚焦显微镜的主流配置。

共聚焦显微镜光谱检测的起源

光谱检测技术最初采用反射式衍射光栅和棱镜系统这两种方法实现。反射光栅技术在20世纪90年代末首次被应用于商业共聚焦显微镜（图1）。此后不久，基于棱镜的共聚焦系统也开始出现。

光谱检测技术虽然带来了灵活性，但与滤色镜的方法相比检测效率稍低，特别是反射光栅的光损耗更高，主要由以下三点原因造成：

高阶衍射损耗：光被衍射光栅反射时会产生多阶衍射。由于只有一级衍射可被检测，因此高阶衍射均被损失掉了。
偏振相关损耗：光的反射率与其偏振态相关，对于反射光栅而言，p偏振光的衍射效率要低于s偏振光的衍射效率。
反射光栅效率的波长依赖性：反射光栅的衍射效率在特定波长达到最大值，而在较高或较低波长的效率则会更差。

受这三个因素的影响，反射光栅是光谱检测方法中效率最低的。基于棱镜的检测方法虽然克服了高阶衍射光损耗的问题，但是在更长波长下的光谱分辨率会降低，且光谱分光精度不均匀非线性。这些缺点使得这两种技术均无法完全取代对滤色镜检测系统的需求。

图1：共聚焦显微镜光谱检测技术的发展

体相全息透射光栅：一种别出心裁的光谱检测方法

近二十年来，反射式衍射光栅和基于棱镜的技术成为共聚焦显微镜制造商实现光谱应用的首选。然而，显微镜并不是唯一使用光谱学作为成像手段的领域，天文学亦是如此。与显微镜类似，由于天文物体（如星系和其他天体）会发射从紫外到红外的光线，天文学家需要通过区分这些光线的成分以获得它们的准确图像。（图2）

图2：光谱学在天文学中用于构建银河系图像。
图片致谢：NASA，ESA，Dan Maoz（以色列特拉维夫大学和美国哥伦比亚大学）

天文学家在其中所使用的关键技术之一就是体相全息透射光栅（Volume Phase Hologram，VPH）。与通过反射光线产生光谱的表面浮雕光栅不同，体相全息光栅使用的是透射方法，让光线通过光栅将入射光衍射成光谱（图3）。使用体相全息光栅的天文学实验最早发表于2000年左右，随后该项技术得到迅速推广。现在，世界上一些大规模的实验室已经成功地将超大型的体相全息光栅应用于光谱学研究上。

图3：反射光栅和透射光栅的横截面
表面浮雕光栅（左）将光线从光栅表面反射，而体相全息光栅（右）让光线透射

在共聚焦领域里，奥林巴斯于2016年推出了具有TruSpectral检测技术的FV3000共聚焦系列。TruSpectral技术使用体相全息进行透射式光衍射的，这也是体相全息技术首次应用于商业显微镜。

在显微镜中使用体相全息光栅具有诸多优势：

低偏振灵敏度
低散射率（高效率）
高光谱透过率（与反射式衍射光栅相比，红色波段尤其突出）
应用比滤色镜更灵活

得益于透射光栅的引入，TruSpectral技术成功克服了许多与常规光谱检测的难题。例如，与反射光栅相比，透射光栅不仅偏振相关损耗极小，还消除了波长对衍射效率的影响。通常情况下反射光栅的角度固定，只能针对一个波长进行优化，而体相全息光栅的角度可以自由调节，能够优化任意波长的效率。

因此，使用透射光栅的共聚焦显微镜，不仅在全光谱范围内实现更高的光透过率，特别是在红光、近红外光和远红外光波段透过率提高三倍。

FV3000共聚焦显微镜体相位全息光栅的工作原理

FV3000共聚焦TruSpectral检测技术使用的体相全息透射光栅具有三大特点（图4）：

体相位全息透射光栅的角度电动可调，根据检测波长自动优化角度
通过电动旋转反射镜可将体相全息光栅产生光谱的特定区域对准检测器（光电倍增管）的靶心，以实现最大效率检测
检测器前端的可调狭缝可在1 nm至100 nm之间以1 nm步进自由调节，灵活调节检测波段

这些功能的组合即可实现从400 nm到800 nm的高分辨率高线性光谱成像和光谱扫描。

图4：FV3000共聚焦显微镜基于体相全息的TruSpectral检测系统原理图

TruSpectral技术对红色荧光染料成像的优势

体相全息透射光栅不仅提高了灵活性，还大幅度提高了检测系统的透射率，这一点在红色到远红色窗口尤其突出。（图5）

由于近红外的光毒性较小，能够更好地穿透组织，还扩展了多重荧光标记能力，因此红移染料在成像应用中日益普及。但由于反射光栅和棱镜的透射率和光谱分辨率较差，使用传统的光谱成像技术很难对红色荧光进行成像。基于体相全息透射光栅的光谱检测不仅可以实现更高的红光透射率，同时确保光谱的精度和分辨率，将高达1 nm光谱分辨率一直扩展到800 nm。

图5：FV3000显微镜基于体相全息透射光栅的TruSpectral检测技术与FV1200显微镜基于反射衍射光栅的光效率对比。与传统的光谱检测方法相比，使用体相全息透射光栅可以将透射率提高多达3倍。

体相全息透射光栅的改进让我们将FV3000共聚焦显微镜设计打造成为全光谱成像系统，这意味着如图4所示，每个检测器都使用基于体相全息透射光栅的TruSpectral检测技术。配合Lambda扫描模式，可对复杂重叠的荧光信号精确进行光谱扫描和拆分，保证每种荧光信号的准确性。（图6）
此外，由于每个独立通道都可灵活调节检测波段，独立调节检测器的参数，让您能够拆分多个不同强度的信号，更好地同时检测亮和暗的荧光。

图6：COS-7细胞的光谱扫描模式可清晰拆分荧光高度重叠的信号

从天文学到显微镜，体相全息透射光栅正在逐步成为光谱实验的强大工具。奥林巴斯FV3000共聚焦独有的TruSpectral技术，清除多色成像中荧光信号串扰的“绊脚石”，助您获取准确明亮的多色荧光图像。

接下来的发展如何，让我们拭目以待！

图7：天文学和显微镜的光谱学应用比较。
（上）一个星系内不同天体所发出光线的光谱分离。（下）一个细胞内四个不同结构的光谱分离。
图片致谢：NASA，ESA，Dan Maoz（以色列特拉维夫大学和美国哥伦比亚大学）

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