在奥林巴斯工作期间，我一度为客户自己动手制作的标本固定器到实验仪器等共聚焦显微镜的创意成果感到惊讶。而且由于我们的FV3000共聚焦显微镜包含正置和倒置两种配置，因此我们可以通过多种方式放置标本。
虽然FV3000显微镜专为荧光成像设计，但只需一点技巧，就可以在特定情况下实现反射光共聚焦成像。尽管反射光共聚焦成像技术很实用，却不被熟知，下面我将介绍使用反射光共聚焦成像的好方法，以便帮助您充分利用您的显微镜系统。
我将重点介绍如何利用反射光共聚焦成像从生物组织中提取内源信息。
纤维状生物分子复合物的反射光共聚焦成像
反射光光路的用途之一是通过增加标本环境信息，更好地获取样品内部信号。
它的工作原理也并不复杂：由于生物纤维蛋白结构与水之间的界面会产生强烈的反射光对比信号，只需将激发光反射到设置了相同波长的TruSpectral检测器上，您就可以识别特定的细胞结构、细胞外基质的组织状态或材料表面特征。
FV3000共聚焦显微镜具有全光谱检测光路，因此每个通道都可用于反射光检测。在与荧光观察结合使用时，反射共聚焦可以获得无荧光标记的细胞亚结构定位。
举个例子：我对免疫荧光标记的大鼠脑部固定切片进行成像。正如您在下面图像中看到的（图1），标准三通道VBF采集了原位特异性标记的神经元树突（橙色）、含有多巴胺或去甲肾上腺素的儿茶酚胺能神经元（品红色）、以及染料标记的细胞核（青色）。
图1：用抗体对大鼠大脑切片进行三色免疫荧光标记。上图：用X Line 20X物镜采集的单层图像。底图：局部放大的图像分辨率。
虽然免疫荧光染料已经可以标记多重荧光信号，我们仍可以利用反射光共焦成像方法来获取更多内源性信息。
通过同时使用四个通道对激光405、488、561和640 nm的反射光成像，我们可以得到该组织内部髓神经元的多色图像（图2和3）。
 图2 (左)：图1中所示的三通道免疫荧光信号的合并。右：与左图同一视场下，用四通道同步采集激光405、488、561和640 nm的反射光共焦成像的合并图像。 |  图3 (上)：同步采集的四色激光反射光共聚焦成像。下图：含多巴胺神经元的免疫荧光图像与内源性轴突髓鞘的多色反射光共聚焦图的合并图像。 |
您可以使用反射光共聚焦成像这种无荧光标记图像的信息判断在感兴趣神经元上发生髓鞘化的程度，这些神经元已通过免疫荧光进行选择性标记，或有助于研究轴突追踪。
反射光共聚焦成像也可用于细胞或组织3D培养中细胞外基质的图像采集。正如下图（图4）所示，在血管再生过程中生长的新血管与周围基质环境中的胶原纤维紧密相互作用。
图4: 胶原蛋白基质内3D打印血管的Z投影。上图：罗丹明标记内皮细胞的荧光共聚焦图像。中图：纤维状胶原网络和靠近血管重塑区域的405 nm反射共聚焦图像。下图：通道合并的图像。比例尺为100 µm。
通过使用Advanced Solutions Life Sciences的Angiomics™分离微血管，在FV3000共聚焦显微镜下可以很清晰地观察到体外天然血管再生，再生血管（通过共聚焦荧光可见）随着在3D基质环境中的生长，将会重新组织它周围的胶原纤维（利用反射光成像可见）。
