细胞膜上的单分子荧光成

使用超高数值孔径（NA）物镜在细胞膜上进行单分子荧光成像

简介

细胞制备和显微镜光学系统的最新进展让活细胞的单生物分子成像成为可能。使用具有超高数值孔径的物镜可以在活细胞的单分子水平上观察诸如生理活性配体与细胞的结合、信号分子的二聚化以及分子复合物的形成等分子动力学。在这项研究中，研究人员使用奥林巴斯超高数值孔径物镜在单分子水平上对细胞膜上离子通道分子间相互作用进行了荧光成像。

超高数值孔径物镜TIRF应用

荧光蛋白（FP）标记的离子通道亚基在非洲爪蟾卵母细胞中表达，并通过TIRF显微镜在单分子水平进行观察（图1，左）。单个FP的随机漂白事件作为“漂白步骤”可以被观察到（图1，右）。单个离子通道络合物中亚基的数量可以通过计算各个荧光点的漂白步骤来确定。

使用TIRF显微镜和超高数值孔径物镜在单分子水平上观察的非洲爪蟾卵母细胞表达的荧光蛋白Kv4.2-mCherry（图2，左）和mEGFP-DPP10（图2，中）图像。每个红色斑点表示一个Kv4.2通道（四聚体）。一些绿色斑点与红色斑点重叠（图2中的白色箭头，右），表明Kv4.2和DPP10形成络合物。通过计算单个荧光点上mEGFP的漂白事件，可以计算出络合物中亚基的数量。1 在图2中，从Kv4.2-mCherry / mEGFP-DPP10斑点观察到四个漂白事件（绿色箭头），表明该络合物中包含四个DPP10亚基。
1 Ulbrich，Maximilian H.和Ehud Y. Isacoff。“膜结合蛋白中的亚基计数。”Nature methods 4, 第4 期(2007): 319–321

结论

由于有效形成浅穿透深度的消逝波场，仅设计用于消逝波照明的高数值孔径物镜即使在弱荧光情况下也可以产生非常高的对比度图像。虽然这种类型观察需要定量测量由于单分子水平荧光损失导致的荧光强度微小变化，但使用具有特殊浸油和盖玻片的超高数值孔径物镜观察有利于非洲爪蟾卵母细胞膜离子通道中分子间相互作用的成像。由于这些图像具有较高信噪比，因此可以定量测量荧光强度的变化。