偏振光显微镜及其对骨骼组织构成材料的启示

简介

偏振光显微镜是一种先进的光学技术，可增强双折射样品的对比度。它为了解各种有机和无机材料的结构和组成提供了独特的视角。

常用的偏振光显微镜有两种：线性偏振和圆形偏振。顾名思义，线性偏振光显微镜使用线性偏振光照亮样品。相比之下，圆形偏振光显微镜采用圆形偏振光，因此对样品内结构的手性（左右方向）特别敏感。这些技术用于生物学、材料科学和地质学等领域，用于检查各种材料的微观结构和特性。

本应用说明详细探讨了这些偏振光技术，重点介绍了圆形偏振光显微镜如何能更好地可视化骨骼组织中的双折射材料。

骨骼组织的双折射材料

双折射是材料的一种特性，当单束入射光线穿过材料时，会分裂成两条不同的光线。皮肤、角膜、肌腱、韧带、肌肉组织、软骨和骨骼，由于它们有组织的各向异性结构（光学特性在所有方向上都不一致），都是会产生双折射的组织和器官。这种双折射会影响骨骼组织（如骨骼和软骨）中的材料与偏振光相互作用的方式。

哺乳动物和鸟类的骨骼是硬质材料，主要由胶原蛋白和磷酸钙组成。骨骼中存在的四种细胞类型是：

1. 成骨细胞，可生成新的骨骼。
2. 骨细胞，嵌入骨基质中。
3. 破骨细胞，可重新吸收骨骼。
4. 造骨祖细胞，可产生成骨细胞。

软骨与骨骼共同作用，形成所谓的骨骼组织。这种特殊的结缔组织既柔韧又坚硬。三种不同类型的软骨是：

1. 透明软骨：最常见的类型，遍布全身，包括鼻、肋骨、气管、喉、支气管和骨骼的关节面。它在胚胎发育和生长过程中发挥着重要作用：形成胎儿骨骼和生长板（后来被骨骼取代）。
2. 纤维软骨：位于脊柱的椎骨之间和某些关节中。
3. 弹性软骨：存在于会厌、声带和外耳中。

众所周知，许多物质都对骨骼和软骨健康有影响。一种是维生素C，又称抗坏血酸。科学研究表明，维生素C对骨骼健康至关重要，因为胶原蛋白的形成需要维生素C，维生素C还能诱导成骨细胞中骨基质基因的表达。在软骨中，维生素C与减缓骨关节炎（一种导致关节退化的疾病）有关，因为它能刺激胶原蛋白的合成。

了解线性偏振光显微镜和圆形偏振光显微镜

要使用偏振光显微镜捕捉骨骼、软骨、维生素C和其他双折射材料的高质量图像，首先必须了解线性偏振光和圆形偏振光的照明方法。

光源会产生非偏振光，这种光会在所有360度方向上振动。当非偏振光穿过偏光镜时，会转换成线性偏振光。线性偏振光穿过样品。如果样品是各向同性的（所有方向上的光学特性一致），则不会影响偏振光，光将保持相同的偏振状态。然而，如果样品是各向异性的，那么当光通过时，就会改变光线的偏振状态。这种偏振变化可使光穿过一个与偏光镜垂直的检偏器。

线性偏振的一个缺点是会形成出现在视场中的等旋线，即马耳他十字图案（带有V形臂的十字）的黑带。当成像样品具有径向对称性时，会导致偏振光围绕径向中心分裂而产生无法穿过检偏镜的光线，就会发生这种情况。马耳他十字会导致强度降低，从而影响图像的量化或分析用途。

而圆形偏振则没有这个缺点。圆形偏振还可以使用偏光镜将普通光转换为在单一平面上振动的光（线性偏振光）。然而，在圆形偏振中，双折射材料（如四分之一波板）要与偏振光路径上的偏光镜成45°角放置。光会发生相移，即光波穿过材料所用时间的差异。这就产生了具有圆形旋转场的光。当圆形旋转光穿过样品时，会在所有360度的旋转位置上发生折射。如果在折射光的路径上放置一块与第一块板成90°的第二块四分之一波板，这种效应就会抵消。这将再次产生线性偏振光，然后可使其穿过检偏镜的透射轴。需要说明的是，两块四分之一波板都相对于偏光镜旋转了45°角，但旋转的方向相反。

图1. 使用Evident公司的偏振光显微镜、SLIDEVIEW VS200研究级玻片扫描仪和MPLFLN40X（0.75 NA）物镜对维生素C晶体进行成像：a）使用线性偏振光显微镜；b）使用圆形偏振光显微镜。（a）使用线性偏振，我们可以看到等旋线特征（黑带）。（b）为同一样品使用圆形偏振，我们看不到任何伪影。
 

使用偏振光显微镜对骨骼、软骨和维生素C进行成像

维生素C，又称抗坏血酸，是一种手性分子。当偏振光穿过维生素C晶体时，分子的手性会导致光的偏振平面出现旋转现象。光的干涉会产生一系列颜色，形成美丽的图像。

图2. 偏振光显微镜下的维生素C图像：a）使用线性偏振，我们可以看到等旋线特征（马耳他十字）；b）使用圆形偏振，不会产生马耳他十字。这里显示的棕色石头状结构是非常厚的晶体。使用VS200研究级玻片扫描仪和MPLAPON50X（0.95 NA）物镜 拍摄的图像。

图3. 结缔组织和骨骼的图像，在偏振光下可观察到不同方向的胶原纤维。a）使用线性偏振光可视化的结缔组织。b）使用圆形偏振光可视化的结缔组织。c）使用线性偏振光可视化的横向骨切片。d）使用圆形偏振光可视化的横向骨切片。横向排列的胶原纤维呈现亮色，而纵向排列的胶原纤维呈现暗色。介于横向和纵向之间方向排列的纤维显示出深浅不一的灰色。使用VS200研究级玻片扫描仪和MPLAPON50X（0.95 NA）物镜拍摄的图像。

在骨骼组织和维生素C研究中使用偏振光成像的重要性

使用偏振光显微镜捕捉美丽的图像在审美上令人愉悦，但这些图像有什么科学意义呢? 就维生素C而言，分子与偏振光的相互作用是化学分析中用来测定维生素C浓度和纯度的一种特性。通常使用偏振计进行测量。

就骨骼而言，使用圆形偏振光显微镜的研究已被用于绘制胶原纤维的取向模式。这与骨应变数据相关。众所周知，主要是横向排列的胶原纤维具有更好的抗压能力，而纵向排列的胶原纤维具有更好的抗拉能力。此外，与板层呈45°角排列的胶原纤维具有更好的抗剪切能力。

研究还表明，软骨中胶原纤维的方向对于抵抗因负荷或运动引起的压力和变形也很重要。软骨内胶原组织的破坏，即使是轻微的，也会引起骨关节炎等病理疾病。

*用于VS200扫描仪的圆形偏振组件目前仅在欧洲、中东和非洲（EMEA）地区有售。请联系您当地的Evident销售代表，了解有关供应情况的详细信息。
 

参考文献

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作者

Laura Lleras Forero，Evident公司欧洲、中东和非洲地区的生命科学研究产品营销经理
Heiko Gäthje，Evident培训学院的高级培训师