使用NoviSight™软件对共培养肿瘤肿瘤微球肿瘤微球进行3D分析

使用NoviSight软件对共培养微球的共聚焦图像进行定量分析，可以评估细胞数量并确定每个细胞的药物敏感性。

引言

由于这类微球体现了癌症的复杂体外微环境，因此使用三维肿瘤微球评估药物的性能非常重要。研究人员由此能够在更加类似肿瘤自然环境的参数条件下评估药物的有效性。

为了测试NoviSight 3D分析软件对该应用的适用性，我们将A549细胞和HeLa细胞的肿瘤肿瘤微球肿瘤微球共培养。然后，我们使用NoviSight软件对这些细胞的药物处理效果进行三维分析。本研究表明，NoviSight软件可以根据对象包含的信息成功用于对对象进行分类，并可通过分析每个参数评估药物的有效性。

图形摘要

优点

• 可以根据信号将两种细胞类型进行分类，以及进行种群分析。
• 可以通过将微球的中央和周围区域分开对药物功效进行空间分析。

方法

细胞制备

将A549人肺细胞和HeLa子宫颈癌细胞（在细胞核中表达EGFP）以不同比例混合。根据EGFP信号的强度校正HeLa细胞的比例（图1^*1）。将细胞种入384孔圆底孔板（每孔200个细胞）中，并在含10％FBS的DMEM中培养3天。轻轻离心孔板以除去孔中的所有气泡。

A549：HeLa-EGFPnls

图1.经过准备的共培养肿瘤微球肿瘤微球^*1

样品制备

样品使用星形孢菌素（STS）在3.7 nM至3.75μM的浓度下处理5小时，以便让A549和HeLa细胞在微球中的比例为1：1。利用膜通透性差异，我们通过用10μM的Hoechst33342（DOJINDO）染色所有细胞核以及用1μM的TO-PRO3（Thermo FisherScientific®）染色死细胞细胞核来确定细胞的活力。然后，我们使用1x PBS洗涤样品3次，并在4°C（39.2°F）下用4％多聚甲醛隔夜固定。成像前，将微球用SCALEVIEW-S4（FUJIFILM Wako）组织透明化试剂在室温下过夜处理。

图像和分析

使用配有A Line超级复消色差物镜（UPLSAPO30XS）的FLUOVIEW®FV3000激光扫描共聚焦显微镜采集微球的荧光图像。调整物镜的校正环，让其与浸没液体的折射率匹配，以获得高质量的图像和3D形态。将其中一些图像导入NoviSight™3D细胞分析软件中，并在其中进行三维重建。NoviSight软件可以识别诸如细胞核之类的对象，并对对象中包含的信号进行各种分析。

结果

共培养微球中的药物敏感性成像

通过将微球透明化并使用FV3000激光扫描共聚焦显微镜对其成像，我们就能够获得共培养肿瘤微球肿瘤微球的深层成像。星形孢菌素处理以剂量依赖性方式增加了死亡细胞的数量（图2^*1）。需要通过三维分析确定哪些细胞死亡，并确定三维细胞球中有多少死细胞。

图2.共培养微球中的药物反应^*1

共培养微球中的药物敏感性分析

Hoechst33342信号使我们能够识别细胞核。根据是否存在EGFP信号，将所有细胞分为两组 - EGFP阳性（HeLa细胞）和EGFP阴性（A549细胞）。根据是否存在死细胞信号（TO-PRO3，红色）将这两组中的细胞进一步分为四组（图3^*1）。计算并绘制A549和HeLa细胞的活细胞占总细胞的百分比图（图4）。结果表明，HeLa细胞对星形孢菌素的敏感性高于A549细胞。

使用NoviSight™软件可对每个共培养肿瘤微球肿瘤微球中包含的细胞类型进行分类，并分析特定于细胞类型的药物反应性。

图3.NoviSight软件可以根据信号将细胞分为4组^*1
*2 右侧两组图像没有显示Hoechst信号
 

星形孢菌素浓度

图4.A549细胞和HeLa细胞之间药物反应性的差异

空间分析策略

由于图像通过三维方式捕捉，因此可以进行更复杂的空间分析。这样就可以分析异源组织（如癌症）中的细胞行为。NoviSight™软件可以设置所要分析的区域。我们设置软件分析每个微球的中心和外围，并创建八个组（图5）。然后，我们在这些区域内进行种群分析（图6）。这种方法可以对共培养肿瘤肿瘤微球肿瘤微球的药物功效进行空间分析。

图5.空间分析示意图
 

图6.NoviSight软件可以对中心部分和外围部分进行分类

药物功效的空间分析

NoviSight™软件不仅可以计算死细胞的数量，还可以分析药物的空间功效。为了演示该功能，我们对共培养微球中的每种死细胞进行了空间分析。计算了每种死细胞与中心和外围区域细胞数量的比率（图7）。在这种情况下，这两个区域之间的药物功效没有差异。中心和外围的死细胞数量均以剂量依赖性方式增加。

星形孢菌素浓度

图7.中心和外围区域药物反应性的差异

结论

使用NoviSight软件和FLUOVIEW®FV3000激光扫描共聚焦显微镜可以对共培养肿瘤微球肿瘤微球中包含的细胞类型进行分类，并可分析特定细胞类型的药物反应性。通过改变共培养物的组合，可以成功复制各种癌症的微环境，并可评估抗癌药的功效。

作者

Hiroya Ishihara，生物评估技术2，研究与发展

*1 虽然它已经成为医学研究中最重要的细胞系之一，但我们必须认识到Henrietta Lacks对科学的贡献是在未经她同意的情况下发生的。这一不公正现象在导致免疫学、传染病和癌症方面重大发现的同时，也引发了关于医学中的隐私、伦理和同意方面的重要对话。
要了解更多关于Henrietta Lacks的生平和她对现代医学的贡献，请点击这里。
http://henriettalacksfoundation.org/