基于成像工作流程的三维癌症细胞球药效评估

在利用人类和实验动物等个体生物评估药物时，测量值会受年龄和生长环境等各种因素的影响，因而很难对来自多个样本的数据进行统计分析。

类器官和细胞球等三维细胞培养模型，可近似模拟器官或组织的体内结构和功能，并可在体外大规模培养。因此，使用这些模型的统计分析结果是高度可再现的。由于三维细胞培养模型能够再现肿瘤中的细胞异质性，所以三维细胞成像分析有助于药物的评估。

利用三维细胞成像分析评估药效的工作流程可分为以下三个阶段（图1）：

制备、培养和处理三维细胞培养模型
采集细胞图像
进行统计分析

本应用说明介绍了每个阶段的基于成像的工作流程。为了分步演示这一工作流程，我们在细胞水平上定量评估了三维癌症细胞球的化合物诱导损伤。

图1.采用Evident技术的三维细胞培养模型的成像工作流程。

1. 制备三维癌症细胞球（预培养）

癌细胞球可近似模拟体内肿瘤的细胞微环境，因此常用于抗癌药物的筛选分析。癌细胞球通常由半球形低粘附细胞培养容器中培养的癌细胞形成。

为了评估药效，我们制备了600µm或更大的癌细胞球。在此过程中，我们采用了CM30培养监测系统。该设备可用于细胞的长期监测，且无需从培养箱中取出细胞，即可跟踪细胞培养的状态。

为了制备癌细胞球，我们将MCF-7乳腺癌细胞以2,000个细胞/孔的密度接种到U型96孔低粘附容器中。接种后，立即将微孔板置于CM30系统中，并将该系统置于二氧化碳培养箱中。CM30系统可让我们监测分散的MCF-7细胞如何形成细胞球，以及细胞球的大小如何逐渐增大（图2）。

图2.(a) 细胞球形成的延时图像。

(b) 生长到目标大小的细胞球的图像。融合度层以蓝色显示了检测到的细胞。

CM30系统通过融合度测量功能自动识别细胞球区域。融合度测量功能以细胞所占面积与整个图像面积之比来计算融合度。图3显示了七天内MCF-7细胞球面积的变化。

图3.显示七天内细胞球大小变化的图像。黄线是系统中设定的融合度目标。

一旦融合度达到所采集图像面积的5%，软件就会测量细胞球面积。在此，我们确定当融合度达到5%时，细胞球直径超过600 µm。我们在软件中为CM30系统设定目标融合度是5%。当细胞达到或超过该融合度时，软件就会发出警报。

为检查警报是否正确，我们在警报发出一天后测量了12个孔中细胞球的大小，并确认所有孔中的癌细胞球直径都达到或超过了600 µm（图4）。

图 4.警报发出一天后时制备细胞球的大小。
(a) CM30系统警报的示例 (b) 制备细胞球的直径（n= 12）。

采用CM30系统来制备细胞球，可以让我们在监测生长状态时无需将容器移入或移出培养箱，也无需研究人员参与。此外，分析软件可以量化细胞球的大小，并在达到目标大小时发出警报。将CM30系统纳入工作流程后，研究人员可将之前监控细胞培养的时间用于完成其他任务。

超过一定大小的癌细胞球接受了不同剂量的三种抗癌药物之一（顺铂、紫杉醇或5-FU）或对照品的处理。处理24小时后，在所有孔中加入Hoechst 33342、碘化丙啶（PI）和Calcein-AM染料。Hoechst 33342、PI和Calcein-AM可分别染色细胞球内所有细胞的细胞核、凋亡细胞的细胞核以及活细胞。染色后，我们用激光扫描显微镜采集了癌症细胞球的图像数据。

2.三维癌症细胞球内细胞的图像采集

我们使用了FLUOVIEW FV3000激光扫描共聚焦显微镜，在单细胞水平上采集了大量癌症细胞球的高分辨率图像。FV3000显微镜上的宏观-微观成像模块让我们无需搜索样品即可采集图像。

图5显示了用宏观-微观成像模块自动采集图像过程的示意图。癌症细胞球在U形孔内的漂浮位置并不一致。为解决这一问题，宏观-微观成像模块首先在较低放大倍率下对整个孔成像，记录感兴趣细胞球的位置（宏观图像）。然后，该模块可在较高放大倍率下仅自动采集细胞球区（微观图像）。这一过程减小了采集图像的大小。同时也有助于降低系统内存的负荷。

图5.FV3000共聚焦激光扫描显微镜上宏观-微观成像模块的示意图。

显微镜采集了60个孔中癌症细胞球的连续Z截面图像。
图6中显示了采集的癌症细胞球中每个细胞的高分辨率图像。与对照组和其他两种抗癌药物组相比，顺铂处理组可见大量PI阳性细胞，表明这种抗癌药物导致了这些细胞死亡。

图6.用于确定细胞生死的图像由宏观-微观成像模块自动采集。

3.三维癌症细胞球内细胞的统计分析

为了确定细胞球内每个细胞的活力，我们采用NoviSight三维细胞分析软件分析了从多个孔中采集的连续Z截面图像。所有细胞核由Hoechst 33342的荧光信号识别。利用基于散点图的圈门处理，将低强度Calcein-AM荧光信号和高强度PI信号的细胞定义为死细胞。相反，高强度Calcein-AM信号和低强度PI信号的细胞定义为活细胞（图7）。然后，即可使用图库来验证分类的有效性。所以，NoviSight软件可让我们根据荧光信号的强度对自动识别的大量细胞进分类。

图7.使用NoviSight软件确定所有细胞的活力。左：每个细胞的Calcein-AM和PI通道荧光信号强度图。右：死细胞和活细胞的图库图像。

如图8所示，我们计算了抗癌药物处理后细胞球中活细胞的百分比。加入不同浓度的紫杉醇和5-FU时，我们观察到活细胞的比例没有显著变化。但是，我们确认了活细胞的比例随顺铂添加浓度升高而下降。NoviSight软件协助了基于三维细胞培养模型的细胞成像分析，从而支持同时评估多种候选药物的疗效。

评估抗癌药物对癌症细胞球疗效时的注意事项

在这项研究中，我们证实了基于成像的解决方案可在每一阶段中都能协助我们了解细胞水平上抗癌药物对癌症细胞球的疗效。

癌症细胞球细胞培养制备过程既耗时又费力的要定量确认抗癌药物的疗效，细胞球必须条件均一（如本研究中细胞球的大小）。借助CM30系统的远程监测功能，我们可在细胞球达到预定大小前检查细胞的增殖情况，而无需从培养箱中取出培养物。此外，CM30系统的警报功能还帮助我们准确地把握了抗癌药物的处理时间。

激光扫描共聚焦显微镜是在细胞水平上观察癌症细胞球对抗癌药物反应的不二之选。在U型孔中培养的癌症细胞球通常被认为位于孔中心附近。实际上，它们的位置往往略微偏离中心。对整个孔成像来找到癌细胞细胞球所在区域需要大量的存储数据，而且非常耗时。FV3000显微镜的宏观-微观成像模块简化了这一过程。这一模块可拍摄整个孔的低倍图像（宏观图像），然后自动确定高倍图像（微观图像）的最佳拍摄位置。这一模块通过只在高倍率下对样品（癌细胞球）成像，从而减小了图像文件的大小并缩短了拍摄时间。

使用FV3000显微镜获取的图像可由NoviSight 3D细胞分析软件以无缝衔接的方式分析。细胞水平上细胞活力信号的统计分析结果表明，加入顺铂以剂量依赖的方式增加了死亡细胞的数目。NoviSight软件的信号强度和细胞位置信息等分析参数支持更高级的分析。药物的评估可通过分析三维细胞球内每个异质细胞的行为来实现，从而近似模拟了体内的细胞环境。

这一工作流程采用了Evident的技术，可在用户分析困难或复杂的三维细胞培养模型时实现自动化、缩短和节省时间以及减轻工作量。这些解决方案组合在一起，可让您实现全程简化的研究工作流程。

了解有关共聚焦成像和图像分析的更多信息。

参考文献

１）Elena M. Tosca et al., Replacement, Reduction, and Refinement of Animal Experiments in Anticancer Drug Development: The Contribution of 3D In Vitro Cancer Models in the Drug Efficacy Assessment. Biomedicines 2023, 11, 1058.