Validação de observações multipontos usando um sistema de monitoramento de incubação

Introdução

Durante o processo diário de cultura de células, a manutenção e o controle adequados das condições da cultura demandam muito tempo e esforço dos operadores. Para gerenciar adequadamente as células em um fluxo de trabalho de cultura de células convencional, os operadores devem remover as células da incubadora e verificar sua condição ao longo do tempo, observando e calculando as contagens de células e a confluência com um microscópio.

Além disso, a qualidade das células deve ser mantida em um nível constante durante a etapa de preparação para melhorar a consistência e a reprodutibilidade dos experimentos. No entanto, podem ocorrer diferenças na qualidade operacional dependendo do nível de habilidade do operador e de outros fatores. Uma vez que a cultura de células é o ponto de partida das pesquisas de ciências da vida e médicas, a qualidade das células afeta significativamente os experimentos subsequentes. Consequentemente, a qualidade das células deve ser mantida e gerenciada adequadamente com base em determinadas condições da cultura.

Nosso sistema de monitoramento de incubação CM30 simplifica esse processo ao monitorar de forma automática e remota as condições da cultura de células no interior da incubadora, 24 horas por dia, 365 dias por ano. Ele também pode visualizar regularmente as condições das células com base nos resultados das análises com IA. Com medições contínuas e padronizadas, o sistema CM30 possibilita que os operadores quantifiquem o estado das células de forma eficiente e reprodutível, sem confiar em sua própria intuição.
 

Estimando o estado das células do recipiente inteiro a partir de observações multipontos

Para manter a qualidade das células, é importante que os operadores observem e gerenciem adequadamente as condições das células diariamente. Antigamente, os operadores gastavam muito tempo e esforço para observar o recipiente inteiro usando um microscópio a fim de determinar a condição das células e o momento adequado para a passagem e a coleta. Atualmente, até mesmo um operador com certa habilidade precisa verificar o campo de observação no interior do recipiente e o recipiente de cultura inteiro, pois o estado de semeadura das células pode ser irregular, dependendo do tipo de célula manipulada, do recipiente e do método de operação.

Por esse motivo, o sistema CM30 pode formar imagens automaticamente do recipiente inteiro uma vez por dia e, em seguida, formar imagens repetidamente de qualquer ponto de observação especificado, permitindo que a câmera continue formando imagens da posição de observação desejada e adquirindo informações periodicamente sobre o recipiente de cultura inteiro.

No entanto, coletar informações sobre o recipiente inteiro em cada ponto de tempo no processo de cultura envolve vários riscos em termos de hardware e software. Por exemplo, o tratamento dos dados é complicado devido à grande quantidade de tempo de aquisição e volume de dados. Além disso, a temperatura no interior da incubadora aumenta devido à operação prolongada do sistema de monitoramento, e os efeitos dessas mudanças ambientais nas células devem ser considerados.

Para obter ao mesmo tempo dados confiáveis e evitar esses riscos, o sistema CM30 conta o número de células em múltiplos pontos de tempo (Figura 1) definidos de acordo com o tamanho do recipiente em cada ponto de tempo e, em seguida, estima o estado da cultura do recipiente inteiro a partir da média dos resultados das análises. Isso permite que o sistema CM30 adquira dados quantitativos com eficiência e com poucos erros em relação às condições reais da cultura.

Neste artigo, apresentamos os resultados da aquisição, comparação e verificação de dados quantitativos* com o sistema CM30 para confirmar a validade da estimativa do estado das células de um recipiente inteiro a partir de múltiplos pontos.

*Este artigo apresenta os resultados de uma verificação interna realizada pela Evident.

Figura 1. Número de pontos da observação multipontos em diferentes recipientes de cultura de células.
 

Verificação comparativa das estimativas de contagem de células

Os tipos de células e recipientes de cultura a seguir foram usados para validação a fim de comparar os resultados da análise das contagens de células.

Tipo de célula, recipiente de cultura (número de pontos da observação multipontos)

• A549, placa de 12 poços (9 pontos por poço)
• NHEK, frasco T75 (25 pontos)

Especificamente, os mesmos parâmetros analíticos foram aplicados ao recipiente inteiro e a cada um dos múltiplos pontos de observação definidos para cada recipiente no sistema CM30 no mesmo ponto de tempo, e os resultados das contagens de células foram comparados. Para comparar os resultados em todo o processo de proliferação celular, também validamos os resultados para cada uma das três densidades celulares: baixa, média e alta.

A validade da observação multipontos do sistema CM30 foi verificada por meio da comparação da contagem de células do recipiente inteiro, que foi estimada a partir da média das contagens de células analisadas em múltiplos pontos definidos para cada recipiente, e da contagem das células estimada por meio da observação do recipiente inteiro como o valor verdadeiro para as três densidades celulares acima.

Para verificar o grau de variação nas contagens de células ao estimar o recipiente inteiro a partir de apenas um ponto de observação, comparamos as contagens de células do recipiente inteiro estimadas a partir das contagens máxima e mínima de células no único ponto de observação obtidas por meio da observação geral acima e as contagens reais de células (valores verdadeiros) do recipiente inteiro.
 

Relevância das observações multipontos usando um sistema de monitoramento de incubação

A Figura 2 abaixo mostra uma comparação das estimativas de contagem (valores verdadeiros) para o recipiente inteiro e as estimativas de contagem obtidas a partir de observações multipontos em uma placa de 12 poços e um frasco T75.

Figura 2. Erro nas estimativas de contagem de células entre o recipiente inteiro e a observação multipontos.

Normalmente, a contagem de células e a análise de confluência são realizadas para a inspeção de qualidade durante o processo de preparação das células com uma precisão de ±10% do valor verdadeiro. Nessa validação, tanto para a placa de 12 poços quanto para o frasco T75, o erro entre o recipiente inteiro e a estimativa baseada na observação multipontos ficou dentro de ±2% ao longo de todo o processo de crescimento.

Portanto, constatamos que as estimativas obtidas a partir das observações multipontos de cada recipiente forneceram dados suficientemente confiáveis sem a necessidade de observar o recipiente inteiro. Mesmo em condições difíceis, como em uma placa de 12 poços com um pequeno número de pontos de observação por área do recipiente, o erro nos valores estimados para o recipiente inteiro ficou dentro de ±2% durante todo o processo de crescimento. Portanto, o número de multipontos do sistema CM30 foi considerado suficiente para estimar a condição celular do recipiente inteiro.

Além de validar a observação multipontos, verificamos o mesmo método quando contamos o número de células em um único ponto de observação em um recipiente e estimamos o estado das células do recipiente inteiro com base nos resultados (Figura 2). Constatamos que ocorreu um erro de contagem de até 60% em uma placa de 12 poços e um erro de contagem de até 129% em um frasco T75.

Para verificar se esse resultado foi causado pela semeadura irregular das células, usamos um mapa de calor do grau de variação nas contagens de células entre os recipientes no frasco T75 (Figura 3). A cor amarela indica áreas de células com mais de 25% de células a mais do que a contagem média geral de células, e a cor azul claro indica áreas com menos de 25% de células. A linha vermelha indica a área de observação multipontos do CM30 (frasco T75), a cor laranja indica a área onde a maior quantidade de células foi detectada e a cor azul indica a área onde a menor quantidade de células foi detectada.

Os resultados da verificação demonstram que até mesmo um operador com certa habilidade que realiza rotineiramente culturas de células pode observar esse tipo de variação da semeadura em certas partes. Eles também demonstram que o risco da estimativa geral é muito alto se um único ponto de observação estiver coberto por uma área que diverge da contagem média de células do recipiente inteiro.

Figura 3. Mapa de calor mostrando o grau de variação nas contagens de células no frasco T75.

Uma vez que as irregularidades da semeadura ocorrem em uma determinada taxa, conforme mostrado acima, estimar o estado das células do recipiente inteiro a partir de um único ponto de observação implica um alto risco de obter resultados que diferem significativamente da contagem real de células, mesmo que não haja grandes problemas na operação da cultura de células do operador. Isso demonstra que é difícil obter dados quantitativos a partir de um único ponto de observação com alta reprodutibilidade. Por exemplo, ao usar um dispositivo de monitoramento limitado a um único ponto de observação, é necessário observar múltiplos pontos movendo a posição do recipiente cada vez para quantificar o estado das células do recipiente inteiro.
 

Conclusão

Nossa validação comparativa do sistema CM30 mostra que é possível estimar dados quantitativos que se aproximam da contagem real de células do recipiente inteiro a partir da média das contagens de células de múltiplos pontos sem observar o recipiente inteiro. Isso demonstra a validade da estimativa do recipiente inteiro a partir de múltiplos pontos. Além disso, considerando que uma determinada quantidade de irregularidades da semeadura ocorre mesmo quando o operador tem certa habilidade, estimar a contagem de células do recipiente inteiro a partir de um único ponto de observação apresenta um alto risco de obter dados significativamente diferentes da contagem real de células.

Os resultados deste estudo sugerem que os dados quantitativos obtidos por meio da observação multipontos no sistema CM30 são confiáveis para o controle de qualidade das células. Eles também sugerem que, mesmo ao simplesmente verificar a condição das células, é importante considerar um certo grau de irregularidade da semeadura e realizar a observação multipontos.

Além dos métodos de análise mencionados acima, o sistema CM30 foi atualizado para melhorar a contagem de células, a confluência e outras funções de análise. A precisão da análise com IA também foi aprimorada com a adição de configurações mais detalhadas para cada parâmetro de análise. Uma vez que o sistema CM30 foca na eficiência e na reprodutibilidade, monitorando quantitativamente as condições da cultura e minimizando a variabilidade humana, ele é a solução ideal para processos de cultura de células com um grande número de tarefas diárias.
 

Autor

Masatoshi Dehari
Soluções para Pesquisa de Ciências da Vida, Marketing Global
Evident