Método de seccionamento óptico SILA para formação de imagem nítida de amostras espessas

Os escâneres de lâminas ganharam popularidade entre os pesquisadores devido à sua estrutura compacta e grande variedade de utilizações. Uma de suas poderosas aplicações é uma combinação com microscopia de fluorescência de campo vasto (WF) para detectar fluorescência em espécimes finos. Para aplicações em espécimes espessos, uma poderosa solução de formação de imagem é a aquisição por iluminação speckle ou SILA. Integrada ao nosso escâner de lâminas para pesquisa SLIDEVIEW™ VS200, a formação de imagem SILA oferece um rápido seccionamento óptico de imagens de lâminas digitais. Este método remove a luz fora de foco das amostras espessas para melhorar o contraste consideravelmente.

Limitações da microscopia de campo vasto

A microscopia de WF é uma técnica de formação de imagem em que uma área relativamente grande de uma amostra é iluminada com a luz de um comprimento de onda (excitação) específico. As moléculas fluorescentemente ativas são distribuídas dentro do volume da amostra e vinculadas a áreas específicas através do processo conhecido como coloração fluorescente. Essas moléculas absorvem o comprimento de onda de excitação e então emitem luz de um comprimento de onda mais longo, o qual é detectado por uma câmera.

O sinal emitido coletado pela câmera vem de todas as moléculas alcançadas pela luz de excitação em todo o volume da amostra, onde o poder da luz de excitação é suficientemente alto. Por este motivo, as estruturas finas tingidas com fluorescência no plano focal são desfocadas pela presença de luz fora de foco. A solução para este problema é a aplicação de métodos de seccionamento óptico, que produzem imagens nítidas e sem desfoque.

Apresentando a tecnologia SPARQ para um rápido seccionamento óptico

A formação de imagem SILA usa a tecnologia SPARQ (desenvolvida pela Bliq Photonics), que combina um algoritmo HiLo¹ e um misturador de speckle para oferecer um rápido seccionamento óptico. Essa tecnologia permite a remoção de luz fora de foco de imagens de campo vasto, alcançando um desempenho semelhante ao da microscopia confocal. ^1-3

Essa tecnologia implica na aquisição de duas imagens da amostra: uma com iluminação uniforme e uma com iluminação estruturada espacialmente, introduzida por speckles de laser aleatórios na amostra. Quando as duas imagens são adquiridas, são integradas no computador para produzir uma imagem sem desfoque. A transição entre os dois estados de formação de imagem é feita com o uso de um misturador de speckles, conforme ilustrado na Figura 1.

Figura 1. Aquisição de uma imagem SILA.

1. Iluminação uniforme

A imagem iluminada uniformemente contém sinais que vêm de objetos que estão em foco e fora de foco. O conteúdo fora de foco aparece desfocado e, por este motivo, contém apenas componentes com frequência espacial baixa. Aplicar um simples filtro passa alta à imagem uniforme filtraria o conteúdo fora de foco e deixaria a imagem de frequência alta uniforme em foco. No entanto, também teria o efeito indesejável de suprimir os elementos de frequência espacial baixa no plano focal.

Para recuperar o conteúdo de baixa frequência da amostra no plano focal, uma iluminação estruturada de alta frequência (produzida pelas speckles) é adquirida e processada. Desta forma, é possível recuperar o sinal de baixa frequência e distinguir o sinal que se origina apenas do plano de interesse.

2. Iluminação speckle

Speckles são flutuações aleatórias que se originam de reflexos difusos ou de eventos de dispersão sobre irregularidades médias, característicos de fontes de luz coerentes, como os lasers. A interferência desses reflexos ou eventos de dispersão gera os padrões granulares aleatórios projetados na amostra.⁴

A iluminação speckle aplica uma modulação espacial de alta frequência à amostra. Uma característica importante deste tipo de iluminação é que o contraste da modulação fica confinado no plano focal do sistema de microscopia. Por este motivo, medir o contraste local da modulação da imagem permite que se determine até que ponto o objeto está em foco ou contém contribuições em foco.

3. Combinação das duas imagens

As altas frequências do plano focal são extraídas da imagem de iluminação uniforme com o uso de um filtro passa alta. Até que ponto o objeto está em foco ou contém contribuições em foco é determinado pela medição do contraste local da imagem de iluminação speckle. Ao aplicar um filtro passa baixa sobre a imagem de medição do contraste local, o sinal em foco de baixa frequência é obtido.

Deste modo, ao ajustar adequadamente os filtros passa alta e passa baixa, o conteúdo em foco de baixa frequência obtido da imagem de iluminação speckle pode complementar o conteúdo em foco de alta frequência obtido da imagem de iluminação uniforme. Mesclar o conteúdo da imagem de alta e de baixa frequência resulta em uma imagem em foco com resolução total que contém todos os componentes de frequência dentro da largura de banda de frequência do sistema de formação de imagem (Figura 2).^1-3

Figura 2. Diagrama do processamento SILA.

É interessante notar que também é possível ajustar o grau do seccionamento óptico simplesmente alterando uma configuração chamada de parâmetro de espessura do seccionamento (ST). Aumentar o parâmetro ST é análogo a aumentar o tamanho do pinhole (orifício de abertura) de um microscópio confocal.

Elevar o valor do ST permite contribuições de um intervalo de contraste de speckle mais amplo (ou seja, um volume de sinal maior) durante o processamento de imagem SILA. A intensidade geral aumenta e a relação sinal-ruído (SNR) se altera em conformidade. No entanto, assim como na analogia com o pinhole, onde o ganho no sinal é devido à coleta fora do plano focal, o aumento do ST resultará em uma imagem SILA menos seccionada do ponto de vista óptico.

Exemplo de um resultado experimental com o Método de seccionamento óptico SILA

Uma secção criostática de 16 µm de rim de camundongo (lâmina preparada com FluoCells nº 3, F24630) foi iluminada por formação de imagem de WF (campo vasto) e SILA. O parâmetro ST foi definido para 2 (escâner VS200, objetiva UPLSAPO40XS, abertura numérica de 1,25, distância de trabalho de 300 µm, câmera Hamamatsu ORCA-Fusion). Este foi escolhido como um parâmetro ideal para iluminação considerando a espessura da amostra. Um parâmetro ST que seja muito pequeno pode resultar em granulação na imagem SILA gerada devido à natureza inerentemente aleatória das speckles.⁵

O comprimento de onda de excitação usado para aquisição foi de 488 nm. Um espelho dicroico multibanda (para DAPI, FITC, Cy3 e Cy5) e um filtro de emissão para isotiocianato de fluoresceína (FITC) foram usados. O tempo de exposição da câmera foi definido para 60 ms. A Figura 3a mostra a imagem de WF e a Figura 3b mostra a mesma região escaneada pela formação de imagem SILA com o ST definido para 2 na mesma posição Z. A melhoria do contraste é observada em toda a amostra. Focando nas áreas de 1 a 4, podemos ver que as imagens SILA mostram visivelmente mais detalhes do que o método de WF.

Figura 3. (a) Imagem de WF de um rim de camundongo tingido com Alexa Fluor 488 com aglutinina de germe de trigo (W-11261). Os retângulos brancos marcam as quatro regiões de interesse (ROIs de 1 a 4) das estruturas comparadas. (b) Imagem SILA com seccionamento óptico, parâmetro ST de 2 e correspondendo a 6,803 µm. As inserções mostram o aumento de zoom nas ROIs (de 1 a 4) com canais mesclados para a formação de imagem de WF e SILA (metade superior: WF, metade inferior: SILA). Podemos ver que o contraste da imagem com a formação de imagem SILA é altamente melhorado. Em comparação, algumas estruturas na imagem de WF quase não são perceptíveis. Observe que as ROIs detalhadas são mostradas com diferentes escalas de intensidade para demonstrar a resolução das estruturas detalhadas.

Design óptico do Sistema de formação de imagem SILA

O dispositivo de seccionamento óptico SILA foi desenvolvido em um escâner de lâminas de campo vasto (nosso sistema VS200) substituindo a fonte de luz de fluorescência regular por uma fonte de luz coerente produzida por diodos de laser acoplados a uma fibra de modo único. A fonte de laser acoplada de modo único é projetada através da unidade misturadora de speckles, a qual gera speckles no plano da amostra para a iluminação estruturada e remove speckles para a iluminação uniforme. Ao controlar com precisão a iluminação a laser e a unidade misturadora, imagens SILA individuais são computadas e montadas em conjunto, formando a imagem de lâmina inteira com seccionamento óptico.

Figura 4. Diagrama da construção de SILA, contendo uma fonte de luz coerente, um misturador de speckles que produz iluminação uniforme ou speckle, uma trajetória óptica contendo uma objetiva que introduz a luz na amostra e coleta a luz emitida e uma câmera como um detector de luz.

Medições da qualidade

1. Tempo de escaneamento

O tempo de escaneamento da formação de imagem SILA foi testado em áreas de 5 mm × 5 mm. Embora tenhamos adquirido um par de imagens para cada campo de visão da câmera, o tempo de aquisição das imagens SILA não dobrou em comparação com as imagens de WF. Por exemplo, observamos um aumento de apenas 53% no tempo de aquisição da objetiva seca 40X. Mais resultados estão ilustrados na Tabela 1.

Tabela 1. Valores registrados do tempo de escaneamento de imagens de WF e SILA adquiridas por uma câmera ORCA-Fusion (Hamamatsu Photonics) com 4 canais (DAPI, FITC, CY3, CY5) e uma exposição de 50 ms para uma área de escaneamento de 5 mm × 5 mm. O aumento do tempo de escaneamento é calculado para cada ampliação individualmente.

2. Resolução

A resolução óptica das imagens SILA é a mesma das imagens de WF. A resolução teórica para objetivas com uma alta abertura numérica (AN) foi simulada como 0,2 µm na direção lateral e 0,45 µm na direção axial. Os valores experimentais da função de dispersão de ponto (PSF) foram medidos por uma objetiva de imersão em óleo (UPLXAPO100XO, AN 1,45) em uma amostra contendo esferas fluorescentes (microesferas TetraSpeck, 0,1 µm, azul/verde/laranja/vermelho escuro fluorescente) com um comprimento de onda de emissão de 520 nm. A largura à meia altura (FWHM) de imagens de WF é de 0,22 µm na direção lateral e 0,47 µm na direção axial. Confirmamos que os valores calculados teoricamente coincidiram com os PSFs medidos experimentalmente em esferas muito pequenas.

3. Capacidade de seccionamento óptico

O ponto forte da formação de imagem SILA está na sua capacidade de realizar o seccionamento óptico. Na Figura 5a–d podemos ver um exemplo de uma sub-região dos rins de camundongo da Figura 3 sob diferentes parâmetros ST, com vistas ortogonais correspondentes na Figura 5e–h. A amostra inteira foi adquirida como uma pilha Z de 39 imagens, com o espaçamento em Z definido para 0,34 µm. Com a diminuição do ST, podemos ver o aumento do contraste entre as estruturas e o fundo, conforme mostrado na Figura 5i. Também podemos identificar as estruturas detalhadas com mais facilidade.

Para demonstrar isso, fizemos a representação gráfica de um perfil de linha na direção X de uma seção Z exatamente no mesmo local para cada parâmetro ST e para a imagem de WF. Comparar os perfis de linha normalizados mostra claramente como os detalhes ficam mais proeminentes com a formação de imagem SILA em comparação com um sistema de WF tradicional. Os picos de intensidade correspondentes às estruturas são mais altos comparados à intensidade do fundo e mais estreitos com a diminuição do parâmetro ST.

Figura 5. Melhoria do seccionamento óptico usando iluminação SILA comparada a WF. (a) Iluminação WF, (b) iluminação SILA com ST10, (c) SILA com ST5 e (d) SILA com ST2. Cada imagem contém uma seta indicando a medição do perfil de linha e a posição do plano de vista ortogonal na direção X (e–h). Cada imagem SILA com parâmetros ST diferentes e cada imagem de WF são adquiridas como pilhas Z, incluindo a vista ortogonal na direção X. As linhas azuis indicam o mesmo plano Z mostrado em a–d. A escala gráfica horizontal corresponde a 20 µm e a escala gráfica vertical corresponde a 5 µm e se aplica a todas as subfiguras. (i) Os perfis de linha registrados estão indicados em a–b e a comparação com WF em azul, SILA com ST10 em laranja, SILA com ST5 em cinza e SILA com ST2 em amarelo. Todas as representações gráficas estão normalizadas em 1. Vemos uma melhoria do contraste ao diminuir o parâmetro ST.

4. Profundidade do campo

O método de seccionamento óptico SILA alcança a formação de imagem de amostras cuja espessura vai além de várias centenas de mícrons. Particularmente, quando as amostras são clareadas, a profundidade de penetração da formação de imagem SILA é limitada apenas pela distância de trabalho da objetiva. Se os espécimes não forem clareados, a luz pode se dispersar pelas estruturas da amostra, impedindo o alcance das camadas mais profundas da célula.⁶

Figura 6. a) A projeção de intensidade máxima (MPI, 188 planos, espaçamento Z = 2,36 μm) de uma imagem SILA (ST = 2) de um intestino de camundongo mostra vasos sanguíneos (azul claro) e vasos linfáticos (magenta). b) O quadrado pontilhado branco indica o aumento de zoom da região de interesse 1 a partir de (a), onde a linha azul indica a posição da vista ortogonal XZ e a linha vermelha indica a posição da vista ortogonal YZ. c) O retângulo azul mostra a vista ortogonal na direção YZ e d) o retângulo vermelho mostra a vista ortogonal na direção XZ. As linhas amarelas indicam o plano Z mostrado em (b). (Secção de intestino de camundongo FluoTissue 450 μm, SUNJin Lab, processada por RapiClear 1.52).

5. Repetibilidade

O processamento de imagem SILA permite a computação de uma imagem com o seccionamento óptico de uma imagem uniforme e speckle. Idealmente, a estrutura speckle seria completamente filtrada e não seria observável na imagem SILA final. No entanto, este não é o caso. A iluminação speckle impõe inerentemente uma pequena variação na intensidade do sinal. Por exemplo, uma speckle pode iluminar um detalhe da amostra em uma imagem e não o iluminar em outra imagem. Esse fenômeno explica as variações da intensidade residual observadas na imagem final. Por definição, essa variação é aleatória e é um ponto forte (seccionamento óptico e profundidade de penetração) e uma limitação da técnica (variação da intensidade do sinal).

Para investigar a variação da intensidade do sinal, gravamos uma sequência de 10 escaneamentos (veja a Figura 7) para quatro parâmetros ST diferentes (veja a Figura 8a). Para cada amostra, o coeficiente de variação (CV) foi calculado em 90 ROIs escolhidas arbitrariamente, contendo estruturas para quantificar a variação da intensidade ao longo da sequência de escaneamento:

Aqui, I_mean,ROI é a intensidade média de fluorescência de uma ROI de um único escaneamento. Enquanto "stdstack" e "meanstack" são, respectivamente, o desvio padrão e os valores medianos de I_mean,ROI, de toda a sequência de 10 escaneamentos. A Figura 7c mostra um exemplo de 25 ROIs e seus perfis de intensidade média de fluorescência em 10 escaneamentos.

O CV, calculado para três diferentes amostras de áreas que contêm estruturas, diminui como uma função de ST (Figura 8b); quando um valor maior do parâmetro de seccionamento é imposto, a força da filtragem espacial na imagem speckle é mais fraca, resultando em variações de intensidade menores nas imagens SILA. O coeficiente de variação de imagens SILA medidas em 3 estruturas diferentes com 90 ROIs detectadas é em média 3,7±1,4%. Em comparação, a variação na intensidade do sinal no modo de WF é de aproximadamente 0,3% e é inerente ao sistema.

Figura 7. a) Exemplo de uma amostra de cérebro de camundongo (tingida com Cy3, espessura de 100 µm) adquirida por formação de imagem SILA com um ST de 10 a um aumento de 40X. Cada área foi escaneada 10 vezes na mesma área e plano focal. b) As regiões de interesse (ROIs) em azul claro mostram as estruturas escolhidas para as nossas medições da intensidade média de fluorescência (Imean,ROI). As escalas gráficas correspondem a 50 µm. c) Perfis de intensidade média das ROIs escolhidas mostradas anteriormente. Cada linha corresponde a uma ROI. Observe que para uma melhor interpretação, apenas uma pequena seção da imagem contendo 25 ROIs é mostrada.

Comparação com outras técnicas de seccionamento óptico

Nas figuras abaixo, comparamos a formação de imagem SILA com microscopia de campo vasto regular, algoritmos de correção de foco, deconvolução e microscopia de escaneamento a laser confocal. A formação de imagem SILA oferece uma grande melhoria no seccionamento óptico e no contraste em comparação com a formação de imagem de WF regular usando um algoritmo de correção de foco. Quando comparada à deconvolução, a tecnologia SILA melhora a qualidade da imagem. Além disso, suas capacidades de seccionamento óptico sem interrupção de outras atividades reduzem o longo tempo de processamento geralmente associado à captura de grandes imagens de lâmina inteira.

Quanto à comparação com a microscopia confocal, a tecnologia SILA fica notavelmente perto em termos de qualidade de imagem. Como esperado, a microscopia de campo vasto sofre com a presença da fluorescência de fundo. Tanto a microscopia confocal quanto a SILA produzem imagens de seccionamento óptico de contraste bem mais alto e revelam detalhes delicados na organização celular, apesar da natureza dispersa da amostra. Mais comparações entre a microscopia confocal e a SILA devem ser feitas para comparar detalhes das imagens e as variações espaciais na distribuição da intensidade. No entanto, o desempenho da tecnologia SILA é suficiente para estudos de colocalização e avaliação qualitativa. A SILA pode atuar como um rápido dispositivo de escaneamento para examinar minuciosamente grandes quantidades de amostras. As amostras com estruturas de interesse podem então ser levadas para o microscópio confocal para formação de imagem quantitativa.

Figura 9. Imagem de uma planária, Schmidtea Mediterranea (objetiva 20X). Três técnicas são comparadas: a) Imagem de WF, b) Imagem de WF usando um algoritmo de correção de foco e c) Imagem SILA com um parâmetro ST de 5. Azul: DAPI; Verde: células internas do intestino; Vermelho: células externas do intestino. Amostras fornecidas por Amrutha Palavalli, Departamento de Dinâmica e Regeneração de Tecidos, Instituto Max Planck de Ciências Multidisciplinares, Goettingen, Alemanha. A escala gráfica corresponde a 500 µm e se aplica a todas as subfiguras.

Figura 10. Imagem de um cérebro espesso de camundongo tingido com MAP2 (objetiva 20X). Três técnicas são comparadas: a) Imagem de WF com uma projeção de imagem focal estendida (EFI), b) Imagem de WF com projeção de EFI e deconvolução aplicada e c) Imagem SILA com projeção de EFI e um parâmetro ST de 2. As escalas gráficas correspondem a 50 µm.

Figura 11. Imagem de uma amostra de cérebro de camundongo marcada com proteína ácida fibrilar glial (GFAP) mostrando neurônios (objetiva 20X). Três técnicas são comparadas: a) Imagem confocal adquirida usando um microscópio FLUOVIEW™, b) Mesma imagem confocal com deconvolução adicional e c) Imagem SILA com um parâmetro ST de 2. A escala gráfica corresponde a 50 µm e se aplica a todas as subfiguras.

Conclusão

O dispositivo de seccionamento óptico SILA para o escâner VS200 nos permite alcançar imagens com melhor contraste para amostras mais espessas. Comparado à microscopia de WF, o tempo de escaneamento aumenta em média em 53% ao usar a objetiva seca 40X. A profundidade óptica que podemos alcançar é limitada apenas pela distância de trabalho da configuração óptica, como confirmamos escaneando amostras muito espessas, com uma espessura de até 500 μm. A resolução axial da SILA é a mesma da formação de imagem de WF, mas o seccionamento óptico é altamente aprimorado e pode ser controlado através do parâmetro de espessura do seccionamento.

Quando um valor maior do parâmetro ST é imposto, a força da filtragem espacial na imagem speckle é mais fraca, resultando em variações de intensidade menores nas imagens SILA, cujas medições nos nossos exemplos indicam uma média de 3,7±1,4%. A variação de intensidade mais alta do parâmetro ST de 1 pode ser limitada aumentando o parâmetro ST. Este ajuste deve ser considerado quando a análise quantitativa das intensidades de fluorescência é necessária.

O sistema nos permite obter rapidamente imagens comparáveis com microscopia confocal ou com deconvolução aplicada. Acreditamos que essa tecnologia pode ser aplicada para um rápido escaneamento de lâminas de amostras espessas e que ela é vantajosa para se obter imagens nítidas e de alto contraste com um foco nítido nos detalhes.

Referências

1. Lim, D., Ford, T., Chu, K.K., and Mertz, J. 2011. "Optically Sectioned In Vivo Imaging with Speckle Illumination HiLo Microscopy." Journal of Biomedical Optics. 16, 016014.
2. Lim, D., Chu, K.K., and Mertz, J. 2008. "Widefield Fluorescence Sectioning with Hybrid Speckle and Uniform-Illumination Microscopy." Optical Letters. 33, 1819–1821.
3. Mertz, J. and Kim, J. 2010. "Scanning Light-Sheet Microscopy in the Whole Mouse Brain with HiLo Background Rejection." J. Biomed. Opt. 15, 016027.
4. 4. Goodman, J. W. 2007. "Speckle Phenomena in Optics: Theory and Applications." Roberts and Company Publishers.
5. Schniete, J., Franssen, A., Dempster, J. et al. 2018. "Fast Optical Sectioning for Widefield Fluorescence Mesoscopy with the Mesolens based on HiLo Microscopy." Sci Rep, 8, 16259.
6. Richardson, D. S. and Lichtman, J. W. 2015. "Clarifying Tissue Clearing." Cell. 162.2: 246–257.

Autores

Anna Zelená, Especialista em Aplicação, Evident Technology Center Europe
Wei Juan Wong, Gerente de Produtos, Evident Technology Center Europe
Gabriel Maranon, Especialista em Produtos, Bliq Photonics
Alicja Gąsecka, Diretora de Produção e P&D, Bliq Photonics
Mariêve Picard, Diretora de Marketing e Vendas, Bliq Photonics
Jeck Borne, Engenheiro de Sistemas, Bliq Photonics

Reconhecimento de toda a equipe do VS200 na Evident Technology Center Europe.