Formação de imagens de fluorescência confocais quantitativas confiáveis usando o Monitor de desempenho de microscópio

Introdução

Embora a formação de imagem por fluorescência por microscopia óptica seja usada principalmente para observação qualitativa, cada vez mais ela é usada na análise quantitativa. Nesse caso, recomendamos uma manutenção regular, uma vez que a potência da fonte de luz pode flutuar, por exemplo, devido a alterações na temperatura ambiente, o que cria imagens de má qualidade. Além disso, a potência do laser também pode flutuar devido a um ligeiro desalinhamento dos elementos ópticos, desde a fonte de laser à estativa do microscópio, causado pela expansão térmica do sistema.

Microscópios confocais são peças complexas do equipamento e exigem um técnico capacitado para avaliação do desempenho e manutenção. A manutenção regular do microscópio é importante para a reprodutibilidade dos experimentos e a qualidade da pesquisa, sendo um aspecto que ainda é ativamente debatido.^1,2,3,4 A Organização Internacional para Padronização (ISO) tem também contribuído para o debate e publicou a ISO 21073 2019, que especifica o desempenho da imagem de microscópios confocais de escaneamento a laser.⁵

Na Evident, sabemos da importância dessa questão e trabalhamos para tratar disso. Quando lançamos o microscópio confocal de escaneamento a laser FLUOVIEW™ FV4000 em 2023, decidimos que ele seria apoiado pelo Monitor de desempenho de microscópio, para ajudar gerentes e usuários de laboratórios centrais a acompanhar três parâmetros importantes que influenciam a formação de imagem confocal quantitativa e que têm impacto na qualidade da imagem.

Neste artigo técnico, discutimos esses principais parâmetros de desempenho e como o Monitor de desempenho de microscópio pode ajudar na formação de imagem quantitativa de melhor qualidade. Também discutimos os princípios e critérios para medir cada característica de desempenho, bem como as vantagens que o Monitor de desempenho oferece a laboratórios centrais e outros que querem maximizar a formação de imagem quantitativa por fluorescência.
 

Fatores de desempenho da formação de imagem quantitativa por fluorescência a monitorar

Em 2022, O. Faklaris et al. publicaram recomendações com relação a sete métricas de desempenho de microscópio que deveriam ser verificadas regularmente, além de diretrizes para medir cada uma delas.⁶ As sete métricas de desempenho de microscópio são: estabilidade da potência de irradiância, desempenho de formação de imagem, nivelamento da iluminação de campo, aberração cromática, deslocamento da platina, repetibilidade da posição da platina e ruído de fundo do detector.

Um desafio, no entanto, é a dificuldade de medir essas características de desempenho sem um nível de conhecimento em microscopia óptica. Como esse conhecimento pode ser difícil de obter, é complicado garantir que a manutenção regular de microscópios faça com que esses sete fatores fiquem dentro da tolerância, especialmente para gerentes de laboratórios centrais que são responsáveis por vários sistemas de microscopia.

Para começar a ajudar, a Evident desenvolveu uma solução que permite aos usuários medir quantitativamente os sinais de fluorescência. As flutuações dos sinais de fluorescência são difíceis de determinar com base na aparência da imagem, por isso, os pesquisadores geralmente não notam esses problemas da mesma forma que outros fáceis de observar, como a aberração cromática durante observações de colocalização ou o deslocamento da platina durante imagens de lapso de tempo. Um dos objetivos do Monitor de desempenho de microscópio é permitir que os pesquisadores notem variações de desempenho mais cedo no processo, e não depois de concluir o experimento de formação de imagem, o que pode levar a resultados incorretos e repetições de trabalho.

Das sete características mencionadas acima, o brilho de um microscópio de fluorescência depende muito de três delas: a estabilidade da potência de irradiância, o desempenho da formação de imagem e a sensibilidade de detecção.
Isso porque o brilho de fluorescência depende da intensidade da luz irradiada na amostra e de como os sinais de fluorescência podem ser detectados.

Em um microscópio de fluorescência, a intensidade da luz irradiada na amostra depende da potência do laser e da área irradiada. A área irradiada é determinada pelo desempenho de formação de imagem, que é uma medida da precisão com que um instrumento óptico pode focar um feixe de uma fonte de luz em um único ponto. Em outras palavras, tanto o foco do feixe de laser quanto a intensidade da luz irradiada em uma amostra variam de acordo com o desempenho da formação de imagem.

Em seguida, o nível de detecção dos sinais fluorescentes depende da sensibilidade de detecção de todo o sistema. Por esse motivo, monitorar as alterações de potência do laser, o desempenho de formação de imagem e a sensibilidade de detecção é importante para obter imagens de fluorescência quantitativas de alta qualidade e consistentes.

Monitorar a potência do laser é importante, porque essa potência irradiada pela lente objetiva pode flutuar devido a mudanças na temperatura ambiente ou vários outros fatores. O Monitor de desempenho de microscópio mede a potência do laser que o sistema FV4000 recebe da saída da fibra. Isso permite que o sistema determine se a potência mudou com relação à instalação do microscópio. Ao ajustar automaticamente a potência de saída do laser, o sistema pode corrigir as flutuações para tornar o valor uniforme ao longo do tempo.

É necessário monitorar a sensibilidade de detecção para entender quantitativamente qualquer redução na eficiência de detecção devido à deterioração dos elementos ópticos ou ao desalinhamento do eixo óptico do pinhole desde a instalação do microscópio. A posição central do pinhole é especialmente importante em microscópios confocais de escaneamento a laser e pode mudar devido a alterações significativas na temperatura ambiente devido a, por exemplo, mudanças de estação. A sensibilidade de detecção pode não precisar ser monitorada se o microscópio estiver em um local de temperatura controlada e constante, mas nem todos os microscópios confocais de escaneamento a laser são instalados nesse tipo de ambiente altamente estável. Além disso, apesar de não ser frequente, poeira e arranhões na superfície da lente podem também reduzir a transmissão de luz. No entanto, como essa mudança é gradual, pode ser difícil notar o lento declínio de desempenho.

As variações no desempenho de formação de imagem são causadas principalmente por arranhões na superfície da lente objetiva, sujeira, óleo de imersão errado ou ajuste incorreto do colar de correção. Sem um bom conhecimento de microscopia, é difícil notar a maioria desses problemas de desempenho de formação de imagem. Em alguns casos, encontramos problemas de desempenho causados por queda da objetiva, mas o gerente do laboratório central continuava sem saber sobre o problema, já que a queda nunca foi relatada.

Embora os problemas acima fossem causados por questões relacionadas à lente objetiva, outros fatores, como desalinhamento de espelhos e lentes com o eixo óptico devido a flutuações de temperatura, são fontes comuns de problemas de desempenho.
 

Como o Monitor de desempenho de microscópio funciona

O Monitor de desempenho de microscópio mede a potência do laser, a sensibilidade de detecção e o desempenho de formação de imagem de maneira independente. Como o sistema mede cada característica é explicado abaixo.

Potência do laser

Uma visão geral do sistema de medição de potência do laser do Monitor de desempenho de microscópio é mostrada na Figura 1. Assim que a medição começa, o sistema executa automaticamente o processo a seguir.

1) Laser de 405 nm configurado a 100%, outros lasers configurados a 0%.

2) O laser é emitido.

3) O laser é refletido parcialmente por um divisor de feixe (BS) localizado imediatamente acima do ponto de entrada da fibra no FV4000.

4) O laser recebido atinge um detector de luz (o monitor de potência de laser ou LPM) instalado no interior do FV4000.

5) O sistema calcula a saída de potência do laser em 100% do valor de saída real do LPM.

6) Define o laser como 0% e depois muda o laser de comprimento de onda curto para 100%.
Repita as etapas 2 a 6 em todos os lasers instalados, em sequência.

_{Figura 1: Esquema do sistema de medição da potência do laser.}

A correção automática da potência do laser é realizada com o valor medido pelo LPM. A saída de corrente medida é comparada com a saída na instalação do microscópio, e a diferença é calculada como uma porcentagem. Os parâmetros de controle do laser são ajustados de acordo com a porcentagem calculada para manter a saída de laser constante. Recomendamos que os usuários ativem essa função de monitoramento da potência do laser antes de cada aquisição de imagem para garantir que ela permaneça constante em cada experimento de formação de imagem.

Para determinar o quanto a potência de laser medida pelo Monitor de desempenho de microscópio corresponde à intensidade de luz real emitida na amostra, acompanhamos a potência do laser medida pelo Monitor de desempenho e a potência do laser emitida pela lente objetiva por seis meses. Os resultados são mostrados na Figura 2. A potência do laser emitido da lente objetiva foi medida com uma lente objetiva UPLSAPO10X.

Como mostra a Figura 2, há uma alta correlação entre a potência do laser medida pelo Monitor de desempenho de microscópio e a potência do laser emitida da lente objetiva. A precisão confirmada é de até 5%. No entanto, quando o valor do laser é baixo, a potência do laser emitido da objetiva não é estável se o instrumento não tiver se aquecido suficientemente. A Figura 3 mostra os resultados registrados durante o aquecimento do sistema em um período de duas horas. As alterações na potência do laser emitido da objetiva foram registradas em seis pontos definidos de laser: 1%, 10%, 25%, 50%, 75% e 100%. Como a Figura 3 mostra, quanto menor a configuração do laser, maior o efeito do aquecimento. Com base nesses dados, recomendamos que os usuários aqueçam o sistema por pelo menos 60 minutos e usem o Monitor de desempenho de microscópio para corrigir a potência de excitação antes de formar imagens.

_{Figura 2: Resultados da comparação entre a potência do laser emitido da lente objetiva e a potência do laser medida pelo Monitor de desempenho.}

_{Figura 3. Variação da saída de potência do laser emitido da objetiva durante o aquecimento em diferentes valores de configuração (1%, 10%, 25%, 50%, 75% e 100%).}

O monitoramento regular da potência do laser pode detectar baixa potência do laser em si, além de defeitos no combinador do laser e na fibra óptica. A manutenção deve ser realizada quando a potência de saída estiver 50% abaixo da potência de saída medida quando o sistema foi instalado. Ao atingir esse limite, a potência do laser pode ser insuficiente para algumas aplicações, como observação profunda, mesmo que a potência de saída real seja sempre corrigida para ser consistente.

Se os lasers forem usados ininterruptamente por várias horas, o calor gerado pelo sistema poderá afetar a temperatura ambiente, o que causará a flutuação da potência do laser. Por isso, recomendamos que os usuários acompanhem o tempo de uso dos lasers e corrija a potência do laser sempre que uma imagem for capturada, pois ela é sensível a mudanças de temperatura.

Sensibilidade de detecção

Duas características são medidas para detecção de sensibilidade: a sensibilidade de cada detector e a posição do pinhole. A Figura 4 mostra uma visão geral do sistema de medição de sensibilidade de cada detector e a Figura 5 mostra um fluxograma da ordem em que as imagens são capturadas por sensibilidade de detecção. Da mesma forma que na medição da potência do laser, assim que a medição começa, o sistema executa automaticamente o processo a seguir.

Sensibilidade de detecção

1) Selecione o divisor de feixe BS10/90 e LIGUE o laser de 405 nm e o detector 1 (a trajetória óptica é ajustada automaticamente para que o laser seja refletido para o detector selecionado).

2) O espelho do cubo de canto inserido na torre de espelhos da estativa do microscópio reflete o laser ao mesmo tempo que reduz a sua potência.

3) O laser passa pelo divisor de feixe e pinhole e chega ao sistema de detecção do FV4000

4) Calcule a sensibilidade relativa do detector (valor mediano da imagem) em comparação com a sensibilidade desse detector no momento da instalação.

5) DESLIGUE o detector 1, LIGUE o detector 2 e repita as etapas 2 a 4.

6) Repita esse processo para todos os detectores instalados.

Posição do pinhole

7) Selecione o detector 1 novamente e repita as etapas 2 a 4 dez vezes em cada uma das 10 posições do eixo óptico do pinhole (5 posições em cada um dos eixos X e Y, em que a superfície do pinhole está no eixo XY).

_{Figura 4: Esquema do sistema de medição da sensibilidade de detecção.}

_{Figura 5: Fluxograma da medição da sensibilidade de detecção.}

A medição da sensibilidade de detecção envolve medir a variação da sensibilidade de cada detector e a posição de deslocamento correta do eixo óptico do pinhole. Uma redução na sensibilidade de detecção geral do dispositivo pode ser resultado do desalinhamento das posições do eixo óptico do pinhole.

Os gráficos da relação entre as 11 posições do eixo óptico do pinhole e os valores de saída correspondentes do sistema de detecção nas direções dos eixos X e Y são mostrados nos gráficos na parte superior esquerda e superior central da Figura 6. Esses gráficos também mostram curvas de aproximação gaussiana criadas com 5 de 11 pontos de dados. Ao usar a aproximação gaussiana, o valor de deslocamento pode ser calculado com um alto grau de precisão mesmo quando não é possível obter os dados na posição central do eixo óptico do pinhole.

A redução na intensidade da fluorescência causada pelo desalinhamento do eixo óptico do pinhole depende do aumento e da abertura numérica (AN) da lente objetiva. A posição do pinhole é conjugada ao plano focal da objetiva, e o tamanho de Airy no plano do pinhole é determinado por três fatores: aumento da lente objetiva, aumento da lente de projeção e tamanho de Airy no plano focal.

O gráfico no canto superior direito da Figura 6 mostra a relação entre o grau de desalinhamento do eixo óptico do pinhole e a intensidade da fluorescência no espécime de célula quando dois tipos de lente objetiva são usados. A parte inferior da Figura 6 mostra três exemplos de imagens de fluorescência, que são imagens de células tiradas com uma objetiva UPLXAPO20X com eixo óptico deslocado em -0,5 AU, 0 AU (padrão) e +0,5 AU, respectivamente. O gráfico no canto superior direito da Figura 6 foi criado de acordo com as intensidades de fluorescência obtidas dessas imagens, além das imagens adquiridas em cada valor de deslocamento usando objetivas UPLXAPO20X (AN 0,8) e UPLSAPO100XS (AN 1,35).

Os resultados são para um aumento de 1× para as lentes de projeção e mostram que, quando o eixo óptico do pinhole é deslocado em 0,32 AU (supondo um tamanho de Airy de 1 para a objetiva UPLXAPO20X), a intensidade da fluorescência é reduzida em 10% para o UPLXAPO20X em a 1,1% para o UPLSAPO100XS. Isso coloca em evidência que o efeito do desalinhamento do eixo óptico do pinhole muda de acordo com a lente objetiva.

_{Figura 6: Valores medidos do desalinhamento do eixo óptico do pinhole em comparação com a sensibilidade de detecção (superior esquerdo, superior central). Intensidade de fluorescência das objetivas UPLXAPO20X e UPSAPO100XS em comparação com o desalinhamento do eixo óptico do pinhole (superior direito). Imagens de células capturadas com uma objetiva UPLXAPO20X com o eixo óptico do pinhole deslocado em 0,5 AU, 0 AU e +0,5 AU, respectivamente (inferior).}

A manutenção é necessária quando a sensibilidade de cada detector cai abaixo de 80% em comparação com o valor medido quando o sistema foi instalado. Os critérios para julgar a posição do pinhole se baseiam na taxa de redução da intensidade de fluorescência ao usar o UPLXAPO20X, que se considera que tem o maior impacto. Como é difícil os pesquisadores ajustarem a sensibilidade do detector e a posição do pinhole por conta própria, recomendamos entrar em contato com a Evident se os resultados continuarem a mostrar “Falha”.

Recomendamos medir a sensibilidade da detecção com frequência e sempre que for necessário formar imagens quantitativas importantes, pois a sensibilidade de detecção pode mudar ligeiramente com as alterações de temperatura ambiente e o aquecimento do sistema.

Desempenho da formação de imagem

A Figura 7 mostra como calcular a função de propagação de linha tridimensional (LSF 3D) usando observações de reflexão tridimensional de um espécime de borda do gráfico. O processo segue as etapas abaixo desde a medição da imagem refletida à avaliação quantitativa do desempenho de formação de imagem.

1) Selecione uma lente objetiva para medir.

2) Defina um espécime de borda do gráfico na platina FV4000.

3) Ligue o laser de 561 nm, defina o divisor de feixe BS10/90 e ative um detector.

4) Configure o pinhole para 2 AU para capturar imagens de reflexão confocal tridimensionais do espécime de borda do gráfico.

5) Extraia as respostas de borda 3D da imagem tridimensional, consistindo em oito direções.

6) Calcule a LSF diferenciando a resposta de borda.

7) Calcule a LSF 3D e os valores de correlação cruzada 2D da LSF com desempenho ideal de formação de imagem. Os valores de correlação foram obtidos usando a correlação cruzada normalizada de média zero (ZNCC).⁷

_{Figura 7: Esquema do método de extração LSF 3D. 8 LSFs são extraídas na direção XZ.}

O Monitor de desempenho de microscópio realiza automaticamente todas as outras tarefas, exceto aquelas que exigem intervenção manual, como o ajuste da lente objetiva, a focalização e a centralização do padrão de borda.

Três abordagens únicas são usadas para medir a LSF 3D com alta precisão. Primeiro, definimos intencionalmente o pinhole em 2 AU para detectar uma maior intensidade de luz refletida, mesmo durante a desfocalização. Segundo, usamos um espécime com até apenas 8 pares de listras claras/escuras em comparação com um gráfico de estrela comum, o que previne interferência da luz refletida de pares adjacentes durante a desfocalização. Terceiro, tornamos o padrão de borda extremamente fino, o que nos permite obter respostas de borda perto dos valores teóricos. Essas abordagens resultam em medições de LSF 3D mais precisas e confiáveis.

A função de dispersão de pontos (PSF), comumente usada para avaliar desempenho de formação de imagem, mostra como um único ponto aparece na imagem e pode capturar degradação anisotrópica do desempenho da formação de imagem. No entanto, a PSF mostra como é a formação de imagens de linhas e pode não revelar a degradação de desempenho da formação de imagem em certas direções.

No método descrito acima, a LSF 3D é adquirida em oito direções, fornecendo informações quase equivalentes àquelas de uma PSF tridimensional (PSF 3D). A Figura 8 mostra os resultados simulados de uma PSF 3D e de uma LSF 2D em oito direções quando há aberração de coma, que ocorre quando a objetiva é inclinada e quando a lâmina do espécime ou platina é inclinada em relação à objetiva.
A PSF 3D tem um formato de banana e a LSF 2D tem um formato parecido com uma banana. No entanto, em certas direções, aberrações anisotrópicas, como aberração de coma, não são capturadas pela LSF 2D e podem parecer livres de aberrações. Ao adquirir uma LSF 2D em 8 direções, é possível capturar informações anisotrópicas, além de uma PSF 3D.

_{Figura 8. Comparação entre a PSF 3D e a LSF 3D obtida de uma simulação.}

Para verificar quantitativamente se a LSF em 8 direções é do mesmo nível que a PSF, calculamos a razão de Strehl da PSF e a ZNCC da LSF enquanto variamos o valor das aberrações de coma e esféricas. A razão de Strehl é um valor que indica quantitativamente a intensidade de coleta de luz e é expressa como uma proporção da intensidade central na PSF do sistema óptico real quando a intensidade central na PSF ideal, obtida com um sistema óptico sem aberrações, é 100%. A razão de Strehl é também conhecida por estar altamente correlacionada com a aberração de ondas, que é um indicador para o controle de qualidade das lentes objetivas.

A coma é uma das aberrações que ocorrem ao usar um microscópio, como descrito anteriormente, e a esférica é outro tipo de aberração que pode ser causada por ajuste inadequado do colar de correção da lente objetiva, uso líquido de imersão errado ou adesão acidental de líquido na objetiva ou superfície da amostra. O gráfico mostra os efeitos dessas aberrações. Os valores de ZNCC são médias dos resultados do cálculo em 8 direções. Um gráfico também é mostrado como referência para comparação entre a largura à meia altura (FWHM) da PSF e a razão de Strehl. A razão de Strehl e a FWHM são dois indicadores quantitativos da PSF.

O gráfico na Figura 9 mostra que há uma alta correlação entre a razão de Strehl da PSF e a ZNCC da LSF, com um alto coeficiente de determinação R2 de 0,959 na regressão linear. Isso sugere que a ZNCC da LSF 3D pode ser substituída pela razão de Strehl da PSF 3D. Por outro lado, embora haja uma correlação entre a FWHM e a razão de Strehl, isso sugere que deve haver cautela ao definir um valor de limite uniforme. Por exemplo, se a FWHM medida é 340 nm, pode-se supor que não há problema com o desempenho da formação de imagem, porque ela está próxima do valor teórico de 320 nm. Porém, pode acontecer que a razão de Strehl seja reduzida em 65% devido à aberração esférica. No entanto, a ZNCC calculada da LSF 3D pode ser usada para determinar o desempenho da formação de imagem com uma maior precisão do que a FWHM da PSF.

Outro índice, a medição direta a razão de Strehl, requer um dispositivo separado para medir a aberração de ondas do microscópio, o que dificulta essa medição. Em vez disso, os usuários podem usar a ZNCC para determinar o desempenho da formação de imagem.

_{Figura 9. A relação entre a razão de Strehl calculada a partir da PSF 3D e a ZNCC calculada a partir da LSF 3D (superior) e a FWHM calculada a partir da PSF 3D (abaixo).}

O gatilho relacionado ao desempenho de formação de imagem para exigência de manutenção é disparado quando a razão de Strehl cai abaixo de 80%. Geralmente, o valor de 80% da razão de Strehl é chamado de limite da difração, e uma lente objetiva com razão de Strehl abaixo de 80% tem um desempenho insatisfatório. Recomendamos que os usuários façam uma verificação de desempenho da formação de imagem toda vez que o sistema FV4000 for iniciado. Recomendamos refazer essa verificação se o usuário mudar ou após 24 horas de uso.
 

Aplicações do Monitor de desempenho de microscópio

A Figura 10 mostra os resultados de uma avaliação quantitativa de uma amostra de controle em um experimento de quantificação de fluorescência. A amostra de controle difere de um experimento para outro, mas, neste exemplo, ela é definida como a amostra usada para alinhar o padrão da intensidade de fluorescência. Aqui, o segundo experimento foi realizado um mês após o primeiro. O primeiro experimento foi realizado depois de se estabelecer as condições para observação com fluorescência, e o segundo experimento foi realizado imediatamente depois da ativação do instrumento.

Embora microscópios confocais com laser precisem aquecer de acordo com as especificações do fabricante, os experimentos foram realizados imediatamente após a inicialização para mostrar claramente o efeito. O gráfico da Figura 10 compara a intensidade da fluorescência da primeira e da segunda amostra de controle com e sem o Monitor de desempenho de microscópio.

Os resultados mostram que quando a correção não é realizada com o Monitor de desempenho de microscópio, o desempenho fica imediatamente instável após a inicialização do instrumento e os dados apresentam uma grande flutuação. Por outro lado, quando a correção de desempenho foi realizada, a quantificação da fluorescência foi possível com alta precisão, mesmo em experimentos conduzidos ao longo de dias.

_{Figura 10. A variação na intensidade de fluorescência das amostras de controle durante o experimento de 2 dias.}
 

Resumo

O Monitor de desempenho de microscópio oferece recursos de manutenção automática para o microscópio confocal de escaneamento a laser FV4000. Ele melhora a eficiência do trabalho de manutenção e elimina a necessidade de treinamento de manutenção para outros usuários. Além disso, o sistema faz com que os gerentes não percam tempo com solução de problemas e oferece dados claros, o que facilita comunicar exatamente o que está errado com o sistema de microscópio ao conversar com fabricante, ajudando a reduzir o tempo de inatividade. Como benefício extra, os dados fornecidos pelo Monitor de desempenho de microscópio podem ajudar a instruir os usuários sobre a importância do aquecimento do equipamento, do ajuste do colar de correção da lente objetiva e das flutuações na potência do laser emitido da objetiva.

Para pesquisadores que usam o sistema de microscópio confocal com escaneamento a laser em seus experimentos, monitorar antecipadamente o desempenho do microscópio com relação às flutuações de intensidade de fluorescência pode reduzir significativamente a variabilidade na quantificação da fluorescência, resultando em imagens e dados quantitativos mais consistentes. O recurso de medições semiautomáticas do Monitor de desempenho de microscópio garante que mesmo os usuários novatos possam realizar facilmente essas medições. Além disso, se os resultados do experimento forem inesperados, ele ajudará a identificar se o problema está no microscópio ou na amostra.

Acreditamos que melhorar não só a reprodutibilidade dos experimentos de cada usuário, como também a reprodutibilidade do artigo científico é crucial para os pesquisadores. Para isso, nós na EVIDENT continuamos a nos esforçar para melhorar a rastreabilidade dos dados de medição de desempenho de microscópio.

*Este conteúdo se baseou no desenvolvimento técnico no Centro de Colaboração Aberta (BOCC) RIKEN CBS-EVIDENT e tem patente pendente.
 

Autor

Yasuo Yonemaru
Tecnologia Avançada, P&D, Evident Corporation

1. G. Nelson, et al. “QUAREP-LiMi: A community-driven initiative to establish guidelines for quality assessment and reproducibility for instruments and images in light microscopy”, Journal of Microscopy, vol. 284 (1), 56–73, (2021).
2. U. Boehm, et al. “QUAREP-LiMi: A Community Endeavor to Advance Quality Assessment and Reproducibility in Light Microscopy.” Nature Methods, vol. 18, 1423–1426. (2021).
3. H. K. Jambor. “A Community-Driven Approach to Enhancing the Quality and Interpretability of Microscopy Images.” Journal of Cell Science vol. 136 (24), jcs261837, (2023).
5. ISO 21073-2019 “Optical data of fluorescence confocal microscopes for biological imaging”
6. O. Faklaris, et al. “Quality Assessment in Light Microscopy for Routine Use through Simple Tools and Robust Metrics.” Journal of Cell Biology, vol 221 (11), e202107093, (2022).
7. Lewis, J. P. "Fast Normalized Cross-Correlation." Industrial Light & Magic, 1995.