Tecnologia ASTER para alta precisão de localização em um amplo campo de visão

Todos os nanoscópios SAFe compartilham o mesmo sistema de excitação exclusivo, que é baseado na tecnologia Adaptable Scanning for Tunable Excitation Regions (ASTER - Escaneamento adaptável para regiões de excitação sintonizáveis).¹ O ASTER gera iluminação homogênea nos modos TIRF, HiLo e EPI enquanto realiza modalidades SMLM como PALM, STORM ou PAINT com uma precisão de localização de 10 a 15 nm em 3D em um campo de visão (FOV) de 150 x 150 µm².

Esquema do ASTER e os padrões de iluminação resultantes.

O método de iluminação ASTER oferece uma nova capacidade de explorar todo o FOV de câmeras sCMOS para formação de imagens SMLM e TIRF.

O ASTER usa dois espelhos de galvanômetro para controlar a iluminação no plano da amostra. Enquanto o feixe de excitação mantém sua posição no plano focal traseiro (BFP - Back Focal Plane), uma rotação angular de um galvanômetro induz um ângulo semelhante no BFP, correspondendo a uma posição diferente no plano da amostra.

Aplicando padrões específicos, como rastreamento raster, o ASTER pode fornecer excitação uniforme em FOVs sintonizáveis de até 150 × 150 µm² para todos os modos de excitação (EPI, HiLo e TIRF).

_{Células U2OS tingidas para microtúbulos (anticorpo alfa-tubulina) CF660, mitocôndria (anti-TOMM20) CF680 e cromatina (EdU) AF647. dSTORM 2D multicolorido simultâneo com desmixagem espectral.}

Desmixagem espectral: formação de imagens multicoloridas com um laser, um buffer e uma aquisição

Embora a nanoscopia 3D tenha revolucionado o campo da microscopia de fluorescência ao atingir resoluções sem precedentes, a formação de imagens multicoloridas continua sendo um desafio em SMLM. Essa dificuldade se deve a vários fatores, incluindo aberrações cromáticas, a escolha de buffers e a escolha de corantes compatíveis com moléculas únicas.

Para enfrentar esse desafio, a Abbelight implementou desmixagem espectral na SMLM. Ao separar corantes vermelhos escuros usando um cubo dicróico e algoritmos raciométricos, a desmixagem espectral permite formar imagens multicoloridas simultâneas em SMLM de forma elegante.

Referências

Software poderoso para análise de dados de SMLM

Ao contrário da microscopia de fluorescência padrão, que gera imagens baseadas em pixels, a SMLM produz nuvens de pontos com milhões de localizações e ambiguidades associadas. O software NEO da Abbelight converte esses dados em um pacote fácil de usar, simplificando a aquisição de dados e fornecendo reconstrução de imagem em tempo real e feedback quantitativo.

O software NEO também oferece ferramentas poderosas para processar dados de SMLM para estudar a distribuição espacial e temporal de moléculas únicas localizadas. Isso inclui análise de cluster usando DBSCAN, Voronoi e algoritmos de colocalização como CBC ou algoritmos de rastreamento de partícula única.

Sistemas disponíveis

Compatibilidade do sistema