Uma introdução ao método de contraste gradiente

1. Introdução

Desde a invenção dos microscópios ópticos no século 16, os microscópios de luz contribuíram muito para a pesquisa biológica, incluindo a descoberta de microorganismos e glóbulos vermelhos. No século 19, a tecnologia de coloração de espécimes se desenvolveu e estruturas transparentes podiam ser tingidas com agentes de contraste de cores para facilitar sua visualização. Infelizmente, a coloração é tóxica, o que limita seu uso em espécimes vivos. A partir do século 20, foram desenvolvidos vários métodos para ver objetos transparentes e não tingidos, como microscopia de contraste de fase, tornando-se ferramentas indispensáveis na pesquisa biológica até hoje.

2. Variação de métodos de contraste de fase

Os métodos comuns de visualização de fase para visualizar objetos transparentes sem coloração são brevemente explicados com os respectivos arranjos de elementos ópticos na Figura 1. Os métodos convencionais de visualização de fase são realizados colocando elementos ópticos específicos na pupila do condensador e na pupila da objetiva, respectivamente.

O método de contraste de fase (Figura 1a) usa uma combinação de uma lente do condensador dedicada com uma abertura em anel e uma lente objetiva dedicada que contém um anel de película de fase. Dos raios que passam pela abertura do anel do condensador, aqueles que passam direto pelo espécime passam pela película de fase da pupila da objetiva. Por outro lado, os raios que são desviados pelo espécime passam fora da película de fase, produzindo um contraste de luz e sombra no ponto onde os dois componentes interferem entre si. Uma característica desse processo é que manchas de luz, chamadas halos, aparecem em etapas onde a distribuição do índice de refração muda no espécime. Espécimes espessos não são adequados para este método porque o halo aparece muito forte.

O método de contraste de interferência diferencial (Figura 1b) é um interferômetro de cisalhamento polarizado com prismas Wollaston complementares nas posições da pupila do condensador e da pupila da objetiva. A imagem do espécime torna-se uma imagem dupla ligeiramente deslocada em uma direção fixa, e a etapa do índice de refração do espécime é sombreada para fazê-la parecer tridimensional. Como a interferência de polarização é usada, a observação não é possível se houver uma placa de Petri de plástico ou outro objeto que cause distorção polarizada na trajetória óptica.

O método de contraste de modulação (Figura 1c) limita o feixe de iluminação em uma direção usando a abertura da fenda da pupila do condensador. Guiar o feixe de luz faz com que a porção reta da luz no espécime apareça em cinza, enquanto o contraste da parte refratada mudará de acordo com a direção da refração graças ao modulador da pupila da objetiva. Ao transmitir ou blindar uma porção de luz, uma imagem tridimensional semelhante ao método de contraste de interferência diferencial pode ser obtida. Como a polarização não é usada no método de contraste de modulação, recipientes plásticos como placas de Petri podem ser usados. No entanto, a resolução é ligeiramente reduzida com este método, uma vez que limitar a direção do feixe de iluminação significa uma pequena abertura numérica (AN) de iluminação.

Figura 1. Arranjo óptico de vários métodos de visualização de fase

Os elementos ópticos necessários de vários métodos de visualização de fase. a. Método de contraste de fase, b. Método de contraste de interferência diferencial, c. Método de contraste de modulação, d. Método de contraste gradiente.

3. Método de contraste gradiente

O método de contraste gradiente (Figura 1d) é caracterizado por gerar uma imagem pseudo tridimensional semelhante ao método de contraste de interferência diferencial. Enquanto outros métodos de visualização de fase exigem vários componentes ópticos para gerar contraste em espécimes não tingidos, o contraste gradiente pode ser obtido simplesmente inserindo um filtro ND gradiente na pupila da objetiva.

Princípio do método de contraste gradiente

O filtro ND gradiente inserido na posição da pupila da objetiva tem transmitância monotonicamente decrescente em uma direção. O diâmetro da abertura da lente do condensador projetada na posição da pupila da objetiva é reduzido em certa medida em comparação com o diâmetro da pupila da objetiva. Onde a distribuição do índice de refração da amostra é plana, a imagem de abertura da lente do condensador é projetada na posição central da pupila da objetiva e é subsequentemente afetada pela transmitância perto do centro do filtro ND gradiente (Figura 2a). Quando há uma inclinação na distribuição do índice de refração da amostra, a imagem de abertura da lente do condensador é deslocada do centro do filtro ND gradiente, então quando o feixe de luz refrata no local da amostra, a transmitância geral pelo filtro ND gradiente muda (Figura 2b e c). Por este motivo, ela é projetada com um brilho correspondente à inclinação do índice de refração da amostra, e a distribuição do índice de refração da amostra parece tridimensional (Figura 2d).

A abertura da lente do condensador pode ser ajustada usando o diafragma de abertura. Quando é relativamente grande, a mudança de brilho devido à inclinação do índice de refração da amostra pode não ser suficiente. Por este motivo, a imagem capturada com o sensor de imagem é enfatizada e exibida com contraste fácil de ver.

Figura 2. Ilustração do princípio do método de contraste gradiente

Descrição do princípio de contraste entre luz e sombra em um objeto de fase pelo método de contraste gradiente. a. Onde a distribuição de fase da amostra é plana, o feixe de luz vai direto e passa perto do centro do filtro ND de gradiente. b, c. Se a distribuição de fase da amostra for inclinada, os raios de luz refratam de modo que a direção da inclinação passe pela parte mais clara do filtro ND de gradiente (b) ou (c) pela parte mais escura. d. A imagem de observação é observada com um contraste de luz e sombra dependendo da direção de inclinação da distribuição de fase do espécime.

Recursos do método de contraste gradiente

A imagem de fase produzida pelo método de contraste gradiente tem muitas vantagens em relação aos métodos convencionais de visualização de fase. O método de contraste gradiente pode ser aplicado a espécimes espessos porque os halos não ocorrem ao contrário do método de contraste de fase. Como não é baseado em polarização, ao contrário do método de contraste de interferência diferencial, o método de contraste gradiente pode gerar imagens de espécimes pseudo tridimensionais mesmo através de recipientes plásticos. Além disso, como a AN da iluminação é maior do que a de outros métodos, ele é menos suscetível a problemas causados pela formação de imagem através da tampa de uma placa de Petri com gotículas de água. Essa característica também evita a deterioração da resolução causada pelo emprego de um elemento de blindagem no método de contraste de modulação. Outra vantagem prática é que não há necessidade de uma objetiva ou elementos de comutação dedicados nas conversões de objetiva, tornando a observação mais rápida e fácil.

Configuração óptica para o método de contraste gradiente

A configuração óptica do sistema de imagem APX100 é mostrada na Figura 3. A luz é irradiada no espécime através da trajetória óptica e projetada na superfície da formação de imagem.

Um filtro ND gradiente é colocado em uma posição que é conjugada com a posição da pupila da objetiva. Este filtro entra na trajetória óptica somente quando o sistema está configurado para o método de contraste gradiente. O diâmetro de abertura do condensador é ajustado automaticamente para o valor ideal de acordo com o aumento e o diâmetro da pupila da objetiva.

Figura 3. Configuração óptica do microscópio de fluorescência de bancada APEXVIEW™ APX100 para observação de contraste gradiente de amostras não tingidas

Aplicações de contraste de gradiente

Abaixo, as células Hela nos recipientes 1 e 2 foram observadas com uma objetiva de 10x e as imagens foram capturadas usando os quatro métodos de observação discutidos anteriormente para que as imagens pudessem ser comparadas.

1. Prato com fundo de vidro ※ Tampa de plástico colocada
2. Microplaca de 12 poços ※Gotículas de água aderem à tampa de plástico

Comparação de resultados:

1. A imagem de contraste gradiente é comparável às imagens de contraste de fase e contraste de modulação. Na imagem de contraste de interferência diferencial, o desempenho da polarização é reduzido com a tampa de plástico, então o contraste é baixo.
2. Em comparação com outros métodos de observação, a imagem de contraste gradiente tem um campo de visão mais uniforme e bom contraste. A AN da iluminação é maior do que outros métodos de observação e é menos afetada por corpos estranhos no espécime e gotículas de água no recipiente.

4. Resumo

O método de contraste gradiente é um método de observação de objeto de fase que usa uma configuração óptica simples que requer apenas a adição de um único filtro ND gradiente à pupila da objetiva. Ele funciona bem para observar espécimes vivos e transparentes sem coloração. As vantagens do método de contraste gradiente em comparação com o método de observação de objeto de fase convencional incluem:

• Funciona bem em espécimes grossos
• É eficaz em espécimes em uma placa de Petri de plástico
• As observações podem ser feitas através da tampa de uma placa de Petri, reduzindo assim o risco de contaminação das células cultivadas
• Não é necessária uma objetiva dedicada
• Não é necessária a alternância do elemento na conversão da objetiva

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