Sistemas de escaneamento com microscópio confocal

A formação de imagem confocal recorre à coleta sequencial de luz de pontos individuais de espécime com filtragem espacial, seguida por processamento eletrônico de sinal e, por fim, a exibição visual como os pontos de imagem correspondentes. O processo de coleta de sinal ponto a ponto requer um mecanismo para o escaneamento do feixe focado de iluminação por todo o volume do espécime observado. Normalmente, emprega-se três variações principais de escaneamento na produção de imagens de microscópio confocal. É possível atingir uma operação confocal basicamente equivalente empregando uma platina de espécime com traslado lateral acoplada a um feixe de luz estacionário de iluminação (escaneamento de platina), um feixe de luz escaneada com uma platina estacionária (escaneamento por feixe) ou mantendo tanto a platina quanto a fonte de luz estacionárias durante o escaneamento do espécime com uma matriz de pontos de luz transmitidos por meio de aberturas em um disco giratório Nipkow, também conhecido como disco de escaneamento (consulte as Figuras 1 e 2). Cada técnica tem características de desempenho que proporcionam vantagens para aplicações confocais específicas, mas que limitam seu uso em outras aplicações.

As configurações de escaneamento de platina e escaneamento de feixe são métodos de feixe único, enquanto a abordagem de disco giratório é uma técnica de escaneamento multifeixe. Habitualmente, os sistemas que empregam o conceito de escaneamento de disco Nipkow utilizam fontes de luz não coerente de espectro amplo (p. ex., lâmpadas de descarga em arco) para iluminação em vez de lasers, com a falta geral de brilho representando um fator altamente limitante para seu uso em aplicações de fluorescência. No entanto, junto com a iluminação a laser, as matrizes modernas de microlentes e os sofisticados aprimoramentos no traçado do disco expandiram as possíveis aplicações para microscópios confocais de disco giratório. Os sistemas de disco Nipkow podem ser projetados nas variações de escaneamento em tandem ou monoescaneamento. Na primeira variação, os feixes de iluminação e detecção seguem caminhos em tandem por meio de conjuntos distintos de aberturas idênticas localizadas em lados diametralmente opostos do disco. O sistema de monoescaneamento realiza a iluminação e a detecção ao mesmo tempo por meio de cada abertura giratória no disco, mantendo a coincidência exibida por ambos os caminhos de luz enquanto passam pela objetiva.

Outro método de escaneamento com feixe único tem tido aplicação limitada em microscópios especializados de luz refletida, essencialmente para a inspeção de circuitos integrados. A própria objetiva pode ser escaneada sobre um espécime estacionário utilizando uma fonte de luz estacionária em um sistema de lentes escaneadas. Essa configuração tem vantagens ópticas semelhantes ao escaneamento de platina, mas permite que o espécime estacionário receba sondas de medição ou outras formas de manipulação. Por não ser propícia para escaneamento rápido mediante o uso de uma objetiva convencional relativamente grande, a configuração não tem utilização abrangente.

O microscópio confocal moderno é um sistema eletrônico integrado, normalmente baseado em um instrumento de epifluorescência de campo amplo, com a adição de várias fontes de iluminação a laser, um corpo de varredura contendo componentes eletrônicos e ópticos, um computador e um monitor para exibição de imagem, além do software associado para o controle da aquisição de sinal, processamento e análise de imagem. Na configuração óptica confocal básica, a objetiva forma uma imagem nos pinholes de origem e do detector no mesmo plano do espécime. Ao posicionar os pinholes no eixo óptico do microscópio em planos focais conjugados, as imagens ficam sobrepostas no plano focal do espécime. Embora os fluoróforos fora do plano focal estejam excitados, a detecção fica limitada à emissão que ocorre próximo ao plano focal pela abertura do pinhole detector, que rejeita a luz fora do foco. O microscópio confocal de varredura a laser com feixe único funciona nesse modo de escaneamento de ponto como um dispositivo de amostragem e não foram uma imagem óptica (real). Para viabilizar a formação de imagem, é necessário mover o ponto de amostragem pelo espécime, com a coleta e armazenamento do sinal resultante. O corpo de varredura controla a geração do sinal fotônico necessário para construir a imagem confocal. Os componentes de uma cabeça de varredura comercial comum estão ilustrados na Figura 1 e costumam incluir uma ou mais entradas de laser, conjuntos de filtros de fluorescência, um mecanismo de escaneamento de raster, aberturas variáveis de pinhole, além de detectores (normalmente tubos fotomultiplicadores ou PMTs) para a detecção de vários comprimentos de onda de fluorescência.

Para ampliar o princípio de amostragem de ponto confocal a fim de permitir a geração de um campo de imagem ampliado de espécime, o foco do ponto no espécime é varrido em um padrão de raster semelhante ao padrão empregado para a criar a imagem em uma tela de televisão (e em outras aplicações de vídeo; consulte a Figura 2[a]). Esse mecanismo exige uma varredura horizontal rápida (o rastreamento de linha) em conjunto com uma varredura vertical mais lenta, ou rastreamento de quadro, que desvia a linha de varredura em posições sequenciais desde a parte superior até a parte inferior do quadro. Durante a história do desenvolvimento do microscópio confocal, empregou-se várias técnicas para implementar o escaneamento de ponto, com muitas delas tendo sido refinadas em versões comerciais usadas hoje em dia. Em instrumentos de varredura a laser com feixe único, um mecanismo normal de escaneamento de raster utiliza dois espelhos oscilantes de alta velocidade propelidos por motores galvanométricos que revolvem em eixos mutuamente perpendiculares. A coordenação dos dois espelhos, com um fazendo o escaneamento no eixo x e o outro no eixo y, produz a varredura de raster retilinear. A velocidade de escaneamento dos espelhos é insignificante em comparação à velocidade da luz. Por isso, a fluorescência emitida pode ser coletada pela objetiva e devolvida (ou parcialmente devolvido ) na trajetória original de iluminação para seu plano focal conjugado no pinhole do detector. A variação na intensidade do sinal que ilumina a abertura do detector corresponde a variações na emissão em diferentes pontos no espécime conforme o feixe excitado é escaneado.

Muitas das características de um sistema ideal de escaneamento confocal e necessárias para fornecer um excelente desempenho de formação de imagem são extremamente difíceis de concretizar. Praticamente todas as configurações de sistema de escaneamento apresentam alguma desvantagem operacional, resultando na introdução de diversas modificações ópticas e eletrônicas que tentam corrigir as deficiências. Diversos métodos de implementação de escaneamento de ponto reduzem a sensibilidade ou envolvem concessões profundas em termos de flexibilidade ou qualidade de imagem. Por isso, não estão em uso nos sistemas comercialmente produzidos. Um dos mais importantes requisitos do projeto do sistema de escaneamento é que a pupila da objetiva (a abertura focal traseira) seja completamente preenchida com luz durante todo o ciclo de escaneamento para prevenir a diminuição da iluminação nas extremidades da varredura. A melhor maneira de fazer isso é minimizando a movimentação do feixe na abertura com um traçado de varredura que revolva o feixe em um ponto estacionário que seja conjugado com a abertura traseira da objetiva. A manutenção de um ponto estacionário pivotante quando o feixe é balançado durante o escaneamento é uma operação tecnicamente desafiadora, com alguns sistemas fazendo a compensação de uma pequena quantidade de movimento do feixe com o transbordo da abertura por meio de aumento da expansão do feixe. Essa técnica tem a desvantagem de desperdiçar luz e reduzir a eficiência fotônica do sistema.

Outra propriedade desejável do mecanismo de escaneamento confocal é uma varredura com a maior taxa de quadros possível a fim de proporcionar a flexibilidade de ajuste a vários modos de escaneamento para corresponder à aplicação de formação de imagem. Isso exige inércia mínima dos componentes móveis que produzem o escaneamento do feixe, assim como a minimização do tempo morto do sistema (ou seja, o intervalo entre cada ciclo de escaneamento) durante o qual o feixe não está fazendo o escaneamento do espécime. A proporção de cada intervalo de escaneamento de quadro completo utilizada na varredura efetiva do espécime é conhecida como o ciclo de trabalho do sistema. A minimização de um escaneamento não produtivo do feixe não é essencial apenas para atingir uma alta taxa de quadros, mas em alguns projetos de instrumento, reduz danos fotônicos desnecessários ao espécime resultantes de uma especificação inadequada de ciclo de trabalho.

A capacidade de girar livremente o raster de varredura ao redor do eixo óptico é uma característica muito importante para a formação de imagem confocal como uma maneira de otimizar a direção de varredura em relação ao formato ou a outras características do espécime. Durante a formação de imagem de características alongadas, como feixes de fibras, a orientação da direção de varredura rápida paralelamente ao eixo longo da característica melhor bastante a resolução de tempo do sinal do espécime. Além disso, a capacidade de girar o raster permite que as características do espécime sejam orientadas de modo a utilizar o campo de imagem da maneira mais eficiente. Posicionamentos de escaneamento que não permitam girar a direção do raster podem limitar gravemente a viabilidade do sistema, a menos que o próprio espécime possa ser girado facilmente, uma operação muito mais problemática e normalmente inviável.

A disposição óptica necessária para produzir um movimento linear do ponto de iluminação no espécime é um produto de fatores da óptica geométrica do microscópio, inclusive do fato de que a objetiva tem correção telecêntrica (um sistema de lente telecêntrica posiciona as pupilas de entrada e saída no infinito). Para alcançar a correção óptica total da objetiva, os planos de imagem e do espécime devem permanecer em distâncias fixas em relação à objetiva, com o consequente conhecimento das localizações dos planos de imagem conjugados e planos telecêntricos conjugados. Uma propriedade óptica crucial é que todos os feixes de luz façam interseção em um plano telecêntrico em um ângulo que seja uma função da posição do ponto de origem no plano do espécime. Como um espelho plano é capaz de alterar o ângulo de propagação de um feixe de luz, o posicionamento de um espelho em um plano telecêntrico conjugado no eixo óptico proporciona um mecanismo por meio do qual uma alteração no ângulo do feixe produza um movimento linear do ponto focal no espécime. Portanto, no caso mais simples, o posicionamento de um espelho com seu ponto pivotante no centro do plano telecêntrico conjugado da objetiva produz um escâner de feixe unidimensional capaz de modificar a posição do ponto iluminado no plano do espécime como uma função do ângulo pivotante do espelho. Qualquer plano telecêntrico conjugado é uma imagem do plano telecêntrico da objetiva. Quando há o uso de um sistema óptico intermediário, ele forma uma imagem do espelho na abertura de entrada da objetiva, mantendo as propriedades telecêntricas.

Em princípio, é possível expandir esse conceito de escaneamento em dois eixos perpendiculares ao escanear simultaneamente o espelho em duas direções ou adicionando um segundo espelho. Apesar disso, normalmente são os fatores práticos que determinam o tipo de abordagem adotado para o projeto geral de um sistema específico. Quando houver o uso de dois espelhos para fazer a varredura do feixe em direções perpendiculares, eles devem ser posicionados em planos telecêntricos conjugados, localizados em proximidade um do outro (acoplamento próximo). Ao refletir o feixe em direções ortogonais, esse sistema de escaneamento pode gerar os movimentos rápido e lento de escaneamento nos eixos x e y, necessários para formar uma imagem bidimensional completa.

É possível usar várias disposições de componentes do sistema de escaneamento desde que os requisitos primários sejam atendidos. Para garantir o desempenho com limitação da difração do sistema óptico, é necessário preencher de maneira constante e uniforme o plano focal da objetiva traseira (abertura de entrada) com uma onda planar durante o escaneamento. Como o diâmetro físico dessa abertura varia de acordo com as propriedades da objetiva, é necessário compatibilizar todos os outros componentes com a objetiva ou as objetivas em uso, inclusive pinholes de iluminação. Com a adição de óptica auxiliar, é possível produzir planos telecêntricos conjugados em locais necessários. Se essa abordagem for adotada, também será necessário considerar cuidadosamente as propriedades desses elementos auxiliares em relação à compatibilidade com as objetivas escolhidas para uso com o sistema. As propriedades de feixe de lasers de iluminação, mais especificamente o diâmetro do perfil de feixe gaussiano, são fatores significativos no ajuste do diâmetro do pinhole e de outras variáveis relacionadas à iluminação da abertura de entrada da objetiva.

Na mais simples configuração confocal de escaneamento de feixe, um espelho de varredura está localizado no plano focal traseiro de uma lente de varredura, que está conjugada com o plano focal traseiro da objetiva. A Figura 3(a) ilustra uma disposição com um só espelho, que inclui a lente de tubo exigida por uma objetiva corrigida para o infinito. O escaneamento em um eixo é facilmente concretizado com essa configuração. O meio teoricamente ideal de realizar o escaneamento x-y é com a varredura de um só espelho em ambos os eixos ao mesmo tempo (conhecido como escaneamento cardânico). É mais comum usar dois espelhos de escaneamento e as duas configurações possíveis são ilustradas nas Figuras 3(b) e 3(c). Se os espelhos estiverem no modo de acoplamento próximo (Figura 3[b]), o sistema pode funcionar satisfatoriamente sem exigir óptica interveniente adicional. Com uma maior distância de separação entre os espelhos de escaneamento (Figura 3[c]), é necessário utilizar um sistema de transmissão telecêntrica com várias lentes para otimizar o desempenho óptico.

Embora o mecanismo de realização da varredura de raster x-y seja considerado o aspecto mais crucial do sistema de escaneamento confocal, é necessário ter algum método de escaneamento no eixo z para adquirir uma série de cortes ópticos para formação de imagem tridimensional, além da coleta de imagens bidimensionais x-z ou y-z, assim como para a realização de qualquer forma de escaneamento z em linha livre. As configurações comuns de microscópio alteram a distância entre espécime e objetiva mediante o traslado da objetiva ou da platina do microscópio. É possível executar o movimento de maneira precisa com um impulsionador piezoelétrico ou um galvanômetro, embora com um alcance limitado. No entanto, o mais habitual é o uso de um motor de micropasso para impulsionar o controle de foco fino do microscópio. Em instrumentos modernos, os passos são capazes de posicionamento de foco com um tamanho mínimo do passo na ordem de 10 nanômetros. Para aplicações de fluorescência biológica, o posicionamento z com essa precisão é mais do que adequado.

Avanços tecnológicos em instrumentos de feixe único resultaram no desenvolvimento de instrumentos de escaneamento rápido capazes de fornecer formação de imagem com velocidades de vídeo propícias para acompanhar processos dinâmicos em células vivas. Os escâneres de espelho poligonal giratório podem alcançar velocidades muito altas de varredura e são usados em diversos dispositivos ópticos, mas não fornecem os níveis de iluminação e detecção necessários para a implementação na microscopia de alta resolução. Várias configurações que combinam espelhos de escaneamento com defletores acústico-ópticos (Acousto-optic deflectors, AODs) também foram exploradas. Em algumas disposições, um AOD fornece escaneamento muito rápido em um eixo enquanto um escâner de espelho controla o eixo mais lento. Essa abordagem é aceitável em algumas aplicações, mas é problemática na formação de imagem de fluorescência confocal, pois não permite que a emissão de fluorescência com comprimento de onda mais longo seja devolvida por meio do modulador acústico-óptico, que tem especificidade de comprimento de onda. É possível transmitir o sinal parcialmente devolvido (e ainda oscilando em um eixo) para um fotomultiplicador por meio de uma abertura de fenda ou formar uma imagem em um detector CCD de matriz linear. Embora as imagens resultantes sejam confocais em apenas um eixo, as características são aceitáveis para algumas aplicações. A utilização de escâneres de espelho ressonante com oscilação rápida é uma abordagem mais comum para alcançar altas taxas de quadros em um sistema de feixe único. A maioria dos grandes fabricantes incorporou escâneres ressonantes como uma opção padrão de escaneamento a fim de facilitar imagens de velocidade de vídeo a velocidades de 30 quadros por segundo com campo de visão completo. Ao reduzir no Y, os escâneres ressonantes podem viabilizar velocidades de várias centenas de quadros por segundo para aplicações que exijam alta resolução temporal, como fluxo sanguíneo capilar ou dinâmica de cálcio.

Embora a baixa eficiência de iluminação já tenha limitado o uso em aplicações de fluorescência de alta resolução, as técnicas de escaneamento multifeixe oferecem uma alternativa às configurações de escaneamento de feixe único. Seja na variação de tandem ou de monoescaneamento, os escâneres de disco giratório posicionam centenas de orifícios no plano de imagem intermediária do microscópio. Esses orifícios funcionam como pinholes de iluminação e detecção. A configuração de um sistema comum de escaneamento de disco Nipkow é apresentada na Figura 2(b). Os orifícios no disco são dispostos de modo que um grande número de feixes faça uniformemente a varredura do campo de imagem conforme o disco gira, cobrindo completamente o espécime com uma taxa muito mais alta em comparação aos escâneres de feixe único. Como os microscópios de escaneamento de disco formam uma imagem real, uma câmera CCD ou CMOS pode estar localizada diretamente no plano de imagem, coletando o sinal emitido com uma eficiência quântica muito superior em relação aos níveis apresentados por tubos fotomultiplicadores. Apesar dessa vantagem, que oferece focagem em tempo real e formação de imagem de processos dinâmicos, várias desvantagens limitaram a utilidade prática dos sistemas confocais de escaneamento de disco. Anteriormente, uma das desvantagens mais graves era a dependência habitual de fontes de luz convencionais de espectro amplo, além da perda extrema de luz que ocorre no disco. No entanto, avanços no traçado dos sistemas de disco e a aplicação de fontes de laser ajudaram a superar alguns dos problemas de eficiência. Como cada disco tem orifícios de tamanho fixo, não é possível fazer a correspondência entre o diâmetro do pinhole e a objetiva específica que está sendo usada. Como consequência, as opções de objetivas que terão desempenho ideal com um determinado disco ficam limitadas. Além disso, não é possível otimizar de maneira independente os diâmetros dos pinholes de origem e do detector.

Uma técnica usada para melhorar a ausência de brilho que caracterizava os primeiros sistemas de disco Nipkow foi o uso de microlentes para intensificar a luz de origem. Os sistemas mais antigos transmitiam somente cerca de 1% da iluminação incidente sobre o disco e exigiam o uso de câmeras CCD ou CMOS refrigeradas para compensar o baixo nível de sinal. Os projetos modernos de microscópio de escaneamento de disco incorporam um segundo disco que contém milhares de microlentes e que gira alinhado ao disco Nipkow, amplificando a luz que passa em ambas as direções pelas aberturas do disco Nipkow. Com os avanços nas tecnologias de microlentes, laser e câmeras, os microscópios de escaneamento de disco passaram a ser uma ferramenta indispensável para aplicações em formação de imagem de células vivas.

Conclusões

Com o passar do tempo, vimos a proposta ou a implementação de diversas modificações adicionais de escâner em iniciativas que visam melhorar algum aspecto do desempenho prático de instrumentos confocais. Cada aspecto da microscopia de fluorescência confocal está fundamentalmente relacionado à eficiência e às limitações inerentes da coleta serial de dados. A eficiência com a qual é possível adquirir um sinal útil define o equilíbrio que deve ser atingido entre contraste da imagem e fotodano ao espécime, além de controlar as concessões necessárias na coleta serial de dados entre a resolução especial da varredura de amostragem, a relação entre sinal/ruído e a taxa de aquisição de imagem.

Para a formação de imagem de fluorescência em alta resolução, a tecnologia de escaneamento mais refinada e versátil atualmente disponível é alguma variação que utiliza escâneres de galvanômetro, com a maioria dos grandes fabricantes de microscópios produzindo ao menos um instrumento confocal que utiliza essa metodologia. Por causa da importância da eficiência de fótons, a simplicidade relativa de técnicas de escaneamento com feixe único proporciona a esses equipamentos vantagens sobre os escâneres de disco na maioria das aplicações de fluorescência. Eles são compatíveis com uma ampla gama de sistemas ópticos de microscópio convencional e equipamento de vídeo, aderem aos princípios gerais de microscopia, e a flexibilidade no ajuste do pinhole permite a otimização de variáveis específicas tanto para a parte óptica quanto para o espécime.