Sistemas laser para microscopia confocal

Os laseres comumente usados na microscopia confocal de escaneamento a laser são fontes de luz monocromática de alta intensidade que são ferramentas úteis para uma variedade de técnicas, incluindo a retenção óptica, estudos de formação de imagens de tempo de vida, recuperação após fotobranqueamento e fluorescência de reflexão interna total (total internal reflection fluorescence, TIRF). Além disso, os laseres também são a fonte de luz mais comum na microscopia de fluorescência confocal de escaneamento e têm sido usados, embora com uma frequência menor, em investigações de fluorescência de campo amplo convencionais.

Os laseres emitem pacotes de luz monocromática coerentes, ou seja, a luz do laser está em fase no espaço e no tempo, e podem ser colimados, ou reduzidos, para formar um feixe estreito com uma taxa de expansão muito baixa. Em comparação com outras fontes de luz, os intervalos de comprimento de onda extremamente puros emitidos pelo laser têm uma relação de fase e largura de banda sem paralelo em relação às lâmpadas de tungstênio-halogênio, lâmpadas de descarga em arco ou motores de luz LED. Consequentemente, os feixes de luz laser conseguem percorrer longas distâncias e podem ser expandidos para preencher aberturas ou focados para gerar um ponto muito pequeno com um alto nível de brilho. Apesar das semelhanças comuns a todos os laseres, que incluem um meio de ganho (fonte de luz), uma fonte de excitação (fonte de alimentação) e um ressonador elétrico, estas fontes de luz diferem radicalmente em tamanho, custo, potência de saída, qualidade do feixe, consumo de energia e vida útil.

A coerência da luz monocromática produzida pela maioria dos sistemas de laser introduz problemas na aplicação dessas fontes de luz na microscopia de campo amplo clássica. A dispersão de luz e os padrões de difração são introduzidos pela interferência em cada superfície na trajetória óptica. Além disso, os diafragmas de campo e abertura, bem como a sujeira, também produzem artefatos. É possível minimizar ou eliminar esses efeitos indesejáveis por meio de uma variedade de técnicas. Os métodos mais comuns incluem a cifragem temporária da luz laser variando rapidamente o comprimento da trajetória óptica entre a fonte de luz e o microscópio ou o escaneamento do espécime ponto a ponto, como é o caso em sistemas de microscopia confocal. Adicionalmente, muitas vezes é possível eliminar a interferência e outros artefatos por meio dessa técnica de escaneamento de abertura. Se o comprimento da trajetória ou o estado de coerência do feixe de laser flutuarem em um intervalo mais rápido que o tempo de integração do detector (com efeito, a taxa de quadros de vídeo), os artefatos de mancha e dispersão desaparecem da imagem.

Uma técnica eficaz empregada por alguns pesquisadores para melhorar as imagens de contraste de interferência diferencial (DIC) produzidas com uma fonte de luz laser de íon de argônio é posicionar um calço de vidro circular, girando a 2500 revoluções por minuto, na trajetória da luz. As variações rápidas no comprimento da trajetória óptica são introduzidas pelas diferenças na espessura do calço conforme o calço gira na frente do feixe de laser expandido. Atualmente, geralmente obtém-se a variação do comprimento da trajetória empregando um tubo de luz de fibra óptica para guiar a luz entre a fonte de luz e o microscópio. A vibração da fibra gera mudanças contínuas no comprimento da trajetória óptica, fazendo com que o feixe fique temporariamente incoerente em frequências inferiores às do nível de vibração. As vibrações podem ser geradas por um dispositivo piezelétrico, um alto-falante ou pela ventoinha de refrigeração usada no tubo de laser.

Na Figura 1, está ilustrado um laser pulsado de titânio/safira com bloqueio de modo automático, que é atualmente uma das fontes de excitação a laser preferidas na maioria das investigações de microscopia de fluorescência multifotônica. Os laseres de titânio/safira com bloqueio de modo fornecem um grande intervalo de ajuste de comprimento de onda, de cerca de 690 a mais de 1050 nanômetros, com larguras de pulso de aproximadamente 100 femtossegundos de comprimento. Além disso, esses laseres têm potência o suficiente (superior a 100 miliwatts em todo o intervalo de ajuste) para a saturação da excitação com dois fótons na maioria dos fluoróforos. Para garantir o controle adequado da refrigeração e da umidade do cristal do laser, é bombeado nitrogênio no tubo de laser vedado, que é mantido a uma temperatura constante por um refrigerador externo.

A luz produzida por muitos sistemas de laser é polarizada linearmente, com um vetor de polarização orientado verticalmente. Esta propriedade pode ser explorada em aplicações que requerem uma fonte de iluminação polarizada, como o contraste de interferência diferencial, medições de luz polarizada ou investigações quantitativas de anisotropia de polarização de fluorescência.

As características de coerência e polarização de um feixe de laser são medidas pela distribuição de luz no corte transversal do feixe, ou perfil, que muda com o aumento da distância do espelho de saída do laser. A discussão a seguir das características do feixe de laser é apresentada como uma visão geral que pode ser útil ao empregar laseres na formação de imagem microscópica, retenção de laser e outras aplicações.

Quando um laser opera no modo eletromagnético transversal mais simples, chamado de modo TEM(00), o feixe emitido tem uma frente de onda planar e um perfil de intensidade gaussiana (irradiância). O diâmetro do feixe de laser é comumente definido como o valor no qual a intensidade caiu para e(E-2) (13,5%) do seu valor de pico. O perfil Gaussiano do feixe de laser surge devido à difração, que impede a propagação de um feixe perfeitamente colimado e induz a propagação transversal das ondas de luz. Perto da abertura de saída do laser (denominada campo próximo), as frentes de fase do feixe podem ficar desordenadas. Consequentemente, a forma em corte transversal, o tamanho e o perfil de irradiância do feixe mudam rapidamente com a distância do laser. Em distâncias maiores (campo distante), as frentes de fase estabilizam no perfil Gaussiano resultante. Em algumas referências da literatura, o campo próximo e o campo distante são mencionados com os termos alternativos zona Fresnel e zona Fraunhofer, respectivamente. O campo próximo às vezes também é denominado intervalo de Rayleigh. O campo distante começa a uma distância z definida por

z = A⁰₂/λ

onde A(0) é o diâmetro do feixe na abertura de saída e λ é o comprimento de onda da luz emitida pelo laser. Aplicando esta equação a um laser de argônio que emite um feixe de 0,6 milímetros de diâmetro central a um comprimento de onda de 488 nanômetros, o campo distante começa a aproximadamente 74 centímetros da abertura de saída.

Na Figura 2, apresenta-se um diagrama esquemático da geometria do feixe de laser e da divergência nos campos próximo e distante. Como discutido acima, o feixe pode ser considerado essencialmente um conjunto paralelo de frentes de onda que sofre pouca propagação no campo próximo. Mais além do campo próximo, o ângulo de divergência do feixe (θ), que é medido do centro do feixe até a borda (e(E-2)), fica maior e torna-se o parâmetro crítico na determinação do diâmetro do feixe (D) de acordo com a equação:

Diâmetro do feixe (D) = 2L • tan(θ)

onde D é a variável que representa o diâmetro do feixe e L representa o comprimento da distância da abertura de saída do laser até o ponto de medição no feixe. Na prática, várias características do feixe de laser, incluindo o perfil de irradiância, são fatores críticos em muitas aplicações de microscopia e saber a distância até o campo distante pode ser necessário para configurar o sistema de formação de imagem. A Tabela 1 apresenta os valores calculados dessa distância (usando a equação fornecida acima) para alguns laseres e linhas de emissão comumente usados e os diâmetros centrais de feixe típicos.

Distância até o campo distante

Tabela 1

O fato de o feixe exibir ou não uma natureza Gaussiana é importante para a maioria das aplicações de laser, pois muitas vezes é necessário focar, mudar a forma ou modificar o feixe de outra forma usando lentes e outros componentes ópticos. O feixe Gaussiano tem certas características de transformação definíveis que permitem tirar conclusões sobre como o feixe se propagará através de um sistema óptico.

O raio angular (ou ângulo de divergência do feixe; consulte a Figura 2), designado θ (em radianos), de um feixe Gaussiano no campo distante é aproximado através da expressão:

θ = λ /Ï€a₀

onde a(0) é o raio central do feixe na abertura de saída do laser. O diâmetro central do feixe é uma função do comprimento de onda do laser, do comprimento da cavidade e de outros parâmetros de design da cavidade. Conforme a distância (z) do laser aumenta, o raio central do feixe é dado pela equação:

a(z) = θ_z

Tipicamente, os feixes de laser são caracterizados por parâmetros de propagação do feixe, como o quadrado de M ou K (que é equivalente à recíproca do quadrado de M), determinados a partir de uma combinação de medições de campo próximo e de campo distante da seguinte forma:

M²= Ï€A₀θ/4λ

Os valores menores de M2, que é denominado uma constante de propagação ou fator de propagação, são indicadores de uma qualidade mais alta do feixe, especialmente em relação a um diâmetro e divergência menores. O fator descreve a relação entre o feixe real e um feixe gaussiano ideal.

Os feixes Gaussianos coerentes têm propriedades específicas que os diferenciam de feixes de luz incoerentes em sua propagação e transformação por meio de lentes e espelhos. No caso de um feixe limitado por difração, o perfil de intensidade de um feixe Gaussiano é ele mesmo Gaussiano, desde que o feixe não seja truncado pela abertura da lente. Quando o diâmetro do feixe gaussiano é metade do diâmetro da abertura da lente, o perfil de intensidade do feixe emergente permanece gaussiano. Quando o diâmetro do feixe Gaussiano é igual ao diâmetro da abertura da lente, o perfil de intensidade do feixe de saída é uma mistura da função Gaussiana e da função de um disco de Airy. Finalmente, um diâmetro de feixe Gaussiano significativamente maior do que o diâmetro da abertura da lente produz o perfil de saída de um disco de Airy. No último caso, boa parte da potência do laser pode ser perdida devido ao transbordo da abertura de entrada da lente.

O tema geral da óptica do feixe Gaussiano é amplamente abordado em vários livros e os detalhes não discutidos aqui podem ser obtidos de fontes mais completas. Dois tipos de manipulação do feixe Gaussiano são de particular interesse para microscopistas que usam laseres: a concentração do feixe e a expansão do feixe.

Quando um feixe de laser está focado em um ponto muito pequeno por uma objetiva de microscópio sem aberrações (concentração do feixe), o raio do ponto no foco (a uma distância z) é dado pelas expressões:

a(z) = λf/Ï€a₀

onde f é o comprimento focal da lente. Por exemplo, se uma objetiva de 100X com uma abertura numérica de 1,3 (produzindo um comprimento focal de aproximadamente 1,6 milímetros) for empregada para concentrar o feixe de 488 nanômetros de um laser de argônio com um raio de 0,3 milímetros, o raio do ponto focado (determinado a partir da equação anterior) será de 0,8 micrômetros. Aumentar o raio central do feixe em cinco vezes através da expansão do feixe (como discutido abaixo) resultaria em um raio do ponto focado de aproximadamente 0,16 micrômetros.

É importante observar que densidades de potência extremamente alta são obtidas no ponto focal de um feixe de laser concentrado. Um feixe de 10 miliwatts focado em um ponto limitado por difração de 0,22 micrômetros de diâmetro resulta em uma densidade de potência de aproximadamente 30 milhões de watts por centímetro quadrado. Esses níveis altos de energia podem degradar ou destruir rapidamente os revestimentos de lentes e filtros, bem como causar danos fotoquímicos consideráveis a espécimes biológicos. No entanto, para um tamanho de ponto tão pequeno, a difusão da energia térmica pode ser tão eficaz na água que um feixe no infravermelho próximo de alta energia pode causar poucos danos a um espécime biológico, a não ser que a absorção da energia pelo espécime seja alta o suficiente.

Em muitas aplicações de laseres na microscopia óptica, o feixe de laser é inicialmente expandido usando um expansor de feixe Kepleriano ou de Galileu, que são, na verdade, telescópios invertidos (as características anatômicas de um expansor de feixe de laser típico estão ilustradas na Figura 3). A divergência de um feixe Gaussiano coerente pode ser reduzida e o feixe pode ser colimado de forma ideal ao longo de uma distância maior se o feixe de laser for expandido primeiro. Fazendo referência às equações anteriores, o raio angular do feixe, designado θ, é inversamente proporcional ao raio central do feixe, a(0), na abertura de saída do laser. Portanto, expandir o raio central do feixe diminui a divergência proporcionalmente.

Para muitas aplicações na microscopia, é útil canalizar a saída do laser diretamente na trajetória óptica do microscópio através de uma fibra óptica flexível (como ilustrado na Figura 4). Esta técnica é preferível em relação ao método alternativo de alinhamento rígido do laser e do microscópio, o que requer o uso de uma mesa óptica enorme e sem vibrações, vários espelhos fixos e outros componentes

Quando um feixe de laser é focado por uma lente em uma fibra óptica, a eficiência do acoplamento e as características do feixe que emerge da fibra dependem muito da geometria da fibra. A maioria das fibras ópticas usadas para a emissão de luz laser é fabricada com um núcleo de sílica fundida. Essas fibras consistem em um núcleo interno fabricado com sílica de índice de refração alto e envolto por uma bainha, denominada revestimento, composta de material de índice de refração mais baixo. A reflexão interna total na interface do núcleo e do revestimento impede que a luz escape da fibra ao longo de seu comprimento. O revestimento pode ser composto de sílica, vidro, um fluoropolímero duro ou um silicone macio.

As fibras ópticas são classificadas como monomodo ou multimodo de acordo com o diâmetro de seus núcleos internos. Uma fibra monomodo permite a propagação somente do modo de ordem mais baixa em um comprimento de onda específico (Figura 4). O comprimento de onda propagado e a conservação da polarização da onda são determinados pelo diâmetro da fibra. Embora seja possível que outros comprimentos de onda se propaguem, eles se propagam com eficiência reduzida. Os diâmetros das fibras ópticas monomodo típicas variam de 3 a 6 micrômetros para comprimentos de onda de luz visível e o perfil de irradiância de saída de uma fibra monomodo é Gaussiano.

Uma fibra óptica multimodo permite a propagação de mais de um modo e não é restrita a um único comprimento de onda. Os núcleos internos das fibras ópticas multimodo são maiores do que os das fibras monomodo, variando de aproximadamente 100 micrômetros a 1,2 milímetros de diâmetro. O perfil de irradiância de saída de uma fibra multimodo tem uma forma plana, denominado perfil uniforme, com uma abertura numérica que é determinada pelos índices de refração do núcleo e do revestimento.

O ângulo cônico de aceitação, θ, do núcleo da fibra está relacionado à abertura numérica (AN) da fibra da seguinte forma:

AN = sen θ/(n²núcleo - n²revestimento)^1/2

onde n representa o índice de refração. O acoplamento eficiente da luz laser ao núcleo da fibra ocorre quando a abertura numérica do núcleo da fibra e a da lente de concentração do feixe correspondem. A eficiência da transmissão de luz através de uma fibra óptica normalmente é de até aproximadamente 90%, mas pode ser drasticamente reduzida (a somente 60 ou 70%) devido a dobras com raios muito pequenos (menos de 3 centímetros).

Ao usar qualquer laser, é crucial não só evitar que qualquer luz laser direta ou refletida de forma especular entre nos olhos do observador, mas também evitar que o feixe de um componente do sistema óptico seja refletido de volta para dentro do sistema de laser. O primeiro cuidado é uma precaução de segurança pessoal óbvia, enquanto o segundo cuidado é importante para evitar que um refletor adicional retorne um feixe coerente de volta para dentro do laser, causando possíveis danos ao sistema.

A estabilidade da fonte de luz laser é um aspecto importante em muitas aplicações, especialmente na microscopia quantitativa, onde as flutuações de intensidade de iluminação podem afetar negativamente os resultados dos experimentos. Vários fatores relacionados às flutuações da emissão estimulada e do comprimento da cavidade podem induzir ruído de frequência no feixe de saída, mas outras perturbações que causam flutuações da amplitude podem criar tanto ruído de intensidade de alta frequência como variações lentas (desvio) na potência de saída óptica. Algumas fontes dessas flutuações de intensidade estão relacionadas à função do próprio tubo de laser ou da fonte de alimentação. As fontes mais comuns de ruído no feixe de saída para várias categorias de laser estão listadas baixo:

• Laseres de gás – Desalinhamentos do espelho decorrentes das vibrações do ressonador, ruído de fontes de bombeamento óptico, oscilações de plasma e instabilidades do processo de descarga de íons, flutuações na corrente da fonte de alimentação, microfonia decorrente da turbulência da água de resfriamento e ruído induzido pela ventoinha em sistemas de refrigeração por ar forçado são todos potenciais fontes de ruído.
• Laseres de estado sólido – Algumas fontes de ruído incluem a microfonia, flutuações da fonte da bomba tanto de bombas de lâmpada como de diodo, erros de alinhamento da cavidade e o ruído aleatório relacionado à frequência (denominado ruído 1/f), que está relacionado às flutuações térmicas no meio de laser.
• Laseres de corante – Tanto o ruído (alta frequência) como o desvio resultam da falta de homogeneidade da densidade, de bolhas de ar na solução de corante e de instabilidades da fonte da bomba de corante e da bomba de laser.
• Laseres semicondutores (diodo) – O ruído pode resultar de flutuações na corrente de acionamento (polarização) ou temperatura, e o ruído 1/f é causado pela retenção de transportadores na junção e por outros tipos de efeitos de recombinação do transportador (abertura de elétrons).

Todos os laseres são suscetíveis ao ruído introduzido por suas fontes de alimentação. Fontes de alimentação comutadoras, que se tornaram comuns devido à sua eficiência e tamanho reduzido, são especialmente propensas a introduzir ondulações no sistema de laser em frequências que variam entre dezenas de kilohertz. Essa interferência, quando afeta o feixe de luz nos sistemas de microscopia óptica, pode ser especialmente complicada de diagnosticar e remover. A principal dificuldade deve-se à semelhança com o ruído introduzido no sistema por outras fontes, como os campos eletromagnéticos no ambiente do laboratório. Para alcançar uma estabilidade de saída adequada, os laseres semicondutores devem ser operados com fontes de corrente de diodo que possuam a maior estabilidade elétrica e o menor ruído disponíveis, e com um controle de temperatura preciso. Outras fontes externas de ruído devem ser controladas, incluindo a poeira no laboratório e as vibrações decorrentes do trânsito local e de equipamento de construção.

A intensidade do feixe de laseres de onda contínua (cw) pode ser estabilizada controlando eletronicamente a corrente do tubo ou usando componentes externos que modulam a intensidade de luz. Dois métodos diferentes são frequentemente empregados para controlar a corrente de acionamento do tubo. No modo de corrente constante, a corrente do tubo é controlada diretamente por um ciclo de realimentação eletrônico para minimizar as flutuações. Uma vez que a saída do laser também depende da temperatura, esse tipo de circuito é mais eficaz se for fornecido um controle de temperatura adequado. Os sistemas estabilizadores de potência de saída constante funcionam controlando a corrente de acionamento em resposta a um sinal derivado de um circuito que testa o feixe de saída usando um divisor de feixes e um fotodiodo monitor. Essa disposição física aplica-se a laseres de gás e várias outras geometrias, porém, laseres de diodo menores normalmente são montados em um pacote que já inclui um fotodiodo integral. O fotodiodo monitor testa a emissão da faceta traseira do wafer de laser e produz um sinal que permite o controle de realimentação da potência de saída.

Os componentes externos usados para estabilizar a intensidade do laser geralmente empregam um sistema de realimentação rápida para controlar um modulador elétrico que minimiza as flutuações na potência do feixe. Vários fabricantes disponibilizam um modulador externo de células Pockels (consulte a Figura 5) que pode ser usado, a princípio, para estabilizar a potência de saída de qualquer laser de onda contínua. É possível corrigir grandes flutuações de intensidade (até aproximadamente 50%) usando essa técnica, mas com uma redução proporcional na potência de saída total. Uma grande variedade de funcionalidades de correção é importante para muitos sistemas. O laser de hélio-cádmio, por exemplo, pode exibir variações na potência de saída de cerca de 20% devido, em parte, à forte oscilação de plasma entre certas frequências do feixe. Existem sistemas que são considerados adequados para regular laseres de cw e com bloqueio de modo até alguns centésimos de uma porcentagem de sua potência de saída e em uma faixa de frequência que vai desde a corrente contínua até várias centenas de megahertz, com uma atenuação de ruído de 500:1 ou superior.

Os componentes básicos de um modulador de células Pockels são apresentados na Figura 5. Dispositivos externos para regular a intensidade de saída do laser, semelhantes ao design ilustrado na Figura 5, às vezes são categorizados ou comercializados sob o termo comedores de ruído. O conceito fundamental por trás dos modulares eletro-ópticos que usam o efeito Pockels tem como base um mecanismo de variação das propriedades de polarização da célula a uma taxa extremamente rápida para fornecer um atenuador de feixe variável para o controle da intensidade do laser. O estado de polarização da saída do laser determina a atenuação total do modulador, mas até 80% de transmissão é possível. Após a emissão pelo tubo de laser, uma parte do feixe é desviada por um divisor de feixes para um fotodiodo, que compara a intensidade com uma intensidade de referência predefinida (selecionável) e amplifica o sinal da diferença para que ele possa acionar o modulador de células Pockels eletro-óptico. O sinal amplificado produz uma mudança no índice de refração na célula que gira o plano de polarização, variando assim a atenuação do feixe proporcionalmente à tensão da diferença aplicada. Entre as substâncias que exibem uma mudança nas propriedades de polarização com mudanças no campo elétrico (efeito Pockels) estão o dihidrogenofosfato de potássio e o niobato de lítio, e os cristais desses materiais são geralmente usados em moduladores de feixes.

Em situações em que a luz polarizada aleatoriamente é estabilizada por um sistema de células Pockels, o modulador deve estar posicionado entre os polarizadores cruzados e é necessário realizar mais análises para minimizar os efeitos desses componentes adicionais na estabilidade do feixe. Uma vez que a poeira, vibrações e outras interferências podem alterar a estabilidade do feixe em qualquer ponto da trajetória óptica, é importante que os estabilizadores externos sejam posicionados o mais próximo possível da posição do espécime em sistemas de microscopia óptica. Esta medida ajudará a garantir que o feixe mais estável seja emitido para o espécime.

Os laseres de diodo, dispositivos semicondutores que têm sido desenvolvidos por décadas, agora estão disponíveis com uma potência de saída suficiente para interessar os microscopistas. Os laseres de diodo estão disponíveis em uma variedade de comprimentos de onda que vão de ultravioleta ao infravermelho próximo, com uma potência de saída significativa o suficiente para aplicações de microscopia confocal. Além disso, esses laseres de diodo apresentam uma forma e estabilidade do feixe melhoradas, o que permitiu que eles substituíssem os laseres de gás em praticamente todas as aplicações. Os laseres de diodo normalmente têm uma vida útil que varia entre 10.000 e 50.000 horas, mas são extremamente sensíveis a choques eletrostáticos, por isso, devem ser manuseados com cuidado.

O desenvolvimento de laseres de diodo ajustáveis é de grande interesse dos microscopistas, pois eles podem competir em termos de potência e versatilidade com os laseres de corante ajustáveis e com os laseres de titânio/safira (discutido abaixo e ilustrado na Figura 1). Os laseres de corante ajustáveis têm uma faixa de comprimento de onda de 600 a 1800 nanômetros e podem fornecer de 5 a 25 miliwatts de potência. Eles têm as vantagens de um custo relativamente baixo, tamanho compacto, vida útil longa e baixa produção de calor, eliminando a necessidade de sistemas de refrigeração externos.

Os laseres de estado sólido bombeados por diodo (DPSS) usam um laser de diodo em vez de gases nobres, lâmpadas de arco ou lâmpadas de flash para bombear o material de laser de estado sólido. A potência de saída, a qualidade do feixe e a estabilidade apresentadas por laseres bombeados por diodo aproximam-se das de um laser de gás (hélio-neon), mas a eficiência e o tamanho são mais comparáveis com os dos laseres de diodo. Os custos típicos de operação e manutenção dos laseres bombeados por diodo são menores do que os dos laseres de gás e a maioria dos sistemas é refrigerada por convecção ou ar forçado.

Os laseres de granada ítrio alumínio dopados com neodímio (Nd:YAG) bombeados por diodo geram uma luz de 1064 nanômetros na faixa de potência de miliwatts. Duplicar a frequência leva a um dispositivo compacto com uma saída de onda contínua a 532 nanômetros. Também é possível triplicar a frequência para gerar uma saída pulsada a 355 nanômetros. O ressonador firmemente dobrado (tightly folded resonator, TFR) foi desenvolvido para bombear um cristal de fluoreto de lítio ítrio dopado com neodímio (Nd:YLF) com alta potência e eficiência, usando uma matriz de laseres de diodo para gerar vários watts de potência a 1047 nanômetros. Duplicar, triplicar e quadruplicar a frequência neste tipo de laser resulta em saídas de potência de até centenas de miliwatts de luz coerente a 523, 349 e 262 nanômetros (segunda, terceira e quarta harmônicas). Outras vantagens dos laseres de diodo como fontes de bomba incluem uma vida útil prolongada (normalmente mais de 5000 horas, em comparação com algumas centenas de horas das lâmpadas), uma saída colimada e facilmente focada que corresponde ao pequeno volume de laser do laser de estado sólido e um carregamento térmico bastante reduzido da haste do laser, que normalmente requer uma refrigeração a água quando as lâmpadas de arco halógenas são usadas como bombas.

O desenvolvimento de laseres de estado sólido bombeados por diodo tem sido estimulado por aplicações industriais e comerciais que requerem uma alta potência (normalmente vários watts) nas faixas de comprimento de onda verde (532 ou 523 nanômetros) e ultravioleta (355 ou 349 nanômetros, e a quarta harmônica a 266 nanômetros). A saída na região espectral ultravioleta é pulsada, com energias que vão de 100 microjoules a 10 milijoules, durações de pulso na faixa dos nanossegundos e taxas de repetição de até 10 kHz. Esses laseres são muito úteis na microscopia para acionar a liberação de compostos presos. No entanto, as taxas de repetição de pulso ainda são muito lentas para serem usadas como uma fonte de iluminação para a maioria das aplicações de microscopia confocal.

Um desenvolvimento posterior levou à combinação de laseres de estado sólido bombeados por diodo com osciladoresde parâmetros ópticos (OPOs; consulte a Figura 8) para produzir uma saída pulsada e ajustável que é constantemente variável de 205 a 2000 nanômetros. Embora inicialmente os sistemas disponíveis fossem caros e de difícil operação, foram introduzidas versões mais simples e mais adequadas para uso na microscopia.

Os laseres de safira dopados com titânio (normalmente conhecidos como laseres de titânio/safira, consulte a Figura 1) oferecem as vantagens da ajustabilidade para a emissão de luz pulsada e contínua, bem como a confiança do estado sólido. Esses laseres podem emitir pulsos de luz muito curtos (de aproximadamente 80 a 100 femtossegundos) a altas taxas de repetição (100 MHz). A faixa de comprimentos de onda ajustáveis se estende das regiões espectrais do vermelho distante ao infravermelho próximo (700 a 1000 nanômetros). A maioria desses laseres é operada com um bombeamento óptico através de laseres de argônio de alta potência e requer refrigeração a água. Em consequência dos gastos e complexidade envolvidos na operação e manutenção de laseres de titânio/safira, seu uso tem sido limitado principalmente à microscopia multifotônica.

Conclusões

Uma das principais diferenças entre a microscopia de fluorescência a laser confocal e a multifotônica é o tipo de laser usado nessas técnicas muitas vezes complementares. Os laseres para microscopia multifotônica são consideravelmente mais caros e difíceis de operar do que os laseres pequenos refrigerados a ar usados na microscopia confocal.

As aplicações atuais dos laseres na microscopia estão expandindo-se rapidamente nas áreas da microscopia confocal, retenção óptica e liberação de compostos e fluoróforos presos. O desenvolvimento de laseres de estado sólido compactos com linhas de emissão ao longo do espectro devem servir para aumentar ainda mais o uso desses dispositivos na microscopia.