O contraste de modulação Hoffman, também conhecido como contraste de relevo, é uma técnica de microscopia óptica projetada para aumentar o contraste de material não manchado e vivo contido em um recipiente de plástico. Ele funciona detectando gradientes ópticos e convertendo-os em variações de intensidade de luz.

Este post explora o contraste da modulação Hoffman em detalhes, desde a configuração básica do microscópio até suas vantagens e limitações.

Figura 1 Configuração básica do microscópio para contraste de modulação Hoffman

Configuração básica do microscópio para contraste de modulação Hoffman

A Figura 1 mostra a configuração básica do microscópio para contraste de modulação Hoffman. Um filtro espacial de amplitude óptica, denominado "modulador" por Hoffman, é inserido no plano focal traseiro de uma objetiva. A intensidade de luz que passa por este sistema varia acima e abaixo de um valor médio, que é então modulado. As objetivas úteis para contraste de modulação podem cobrir todo o intervalo de aumento de 10X, 20X e 40X.

O modulador tem três áreas (representadas na Figura 2):

• Uma área escura pequena próxima à periferia do plano focal traseiro transmite apenas um por cento da luz (áreas marcadas com D na Figura 2)
• Uma área cinza estreita transmite 15 por cento da luz (áreas marcadas com G na Figura 2)
• A área clara ou transparente restante, que cobre a maior parte da área na parte de trás da objetiva, transmite 100 por cento da luz (áreas marcadas com B na Figura 2)

Ao contrário da placa de fase na microscopia de contraste de fase, o modulador Hoffman é projetado para não alterar a fase da luz que passa por qualquer uma das áreas. Quando vistos sob óptica de contraste de modulação, objetos transparentes que são essencialmente invisíveis na microscopia de campo claro comum assumem uma aparência tridimensional (3D) ditada por gradientes de fase.

No design de Hoffman, as fendas estão no plano focal frontal do condensador, conforme ilustrado na Figura 1. Quando a luz passa pela fenda fora do eixo, ela é visualizada no plano focal traseiro da objetiva (também denominado plano de Fourier) onde o modulador está instalado. O plano focal frontal do condensador que contém a placa de fenda fora do eixo é opticamente conjugado ao modulador no plano focal traseiro da objetiva. A intensidade da imagem é proporcional à primeira derivada da densidade óptica no espécime e é controlada pela ordem zero do padrão de difração do gradiente de fase.

Gradientes opostos resultam no desvio da imagem da fenda para a parte muito escura ou a seção clara do modulador. Considere este exemplo: um suposto espécime que contém gradientes de fase positiva e negativa (espessura) e uma área plana (não gradiente) é projetada usando componentes ópticos de contraste de modulação. O gradiente positivo desvia a luz para a área clara do modulador, onde ela não é atenuada, e 100 por cento dessa luz é transmitida para o plano de imagem intermediário. Da mesma forma, a luz desviada por um gradiente negativo para a área escura do modulador é atenuada em aproximadamente um por cento do seu valor anterior.

Qualquer parte não gradiente do espécime e o fundo são registrados na parte cinza do modulador, onde cerca de 15 por cento da luz é transmitida no plano de imagem intermediário O resultado é que a intensidade da área da imagem de um lado do gradiente é escura. A intensidade do lado oposto do gradiente produz uma área de imagem brilhante e as áreas não gradientes aparecem em cinza na imagem, assim como o fundo.

4 principais vantagens do contraste de modulação Hoffman

Existem inúmeras vantagens e algumas limitações com o contraste de modulação Hoffman Algumas vantagens do contraste de modulação Hoffman incluem:

1. Uso completo da abertura numérica da objetiva.

A capacidade de usar aberturas numéricas mais altas com contraste de modulação Hoffman produz excelente resolução de detalhes juntamente com bom contraste e visibilidade da amostra.

2. Funciona com recipientes plásticos.

O contraste de modulação Hoffman pode ser usado com sucesso com materiais birrefringentes, como pratos de plástico, sem distorção de imagem. Birrefringência, ou refração dupla, é o fenômeno exibido em determinados materiais onde um raio incidente (um raio de luz que atinge uma superfície) é dividido em dois raios quando ele passa pelo material.

O contraste de modulação Hoffman é uma boa alternativa aos métodos de contraste que não funcionam bem com materiais birrefringentes. Por exemplo, examinar materiais birrefringentes com contraste de interferência diferencial (DIC) pode levar a artefatos, perda de contraste e outros problemas de qualidade de imagem.

Como resultado, o contraste de modulação Hoffman é um método ideal para observar e formar imagens de células, tecidos e culturas de órgãos em recipientes de plástico.

3. A capacidade de realizar segmentação óptica.

Também é possível fazer "segmentação óptica" com esta técnica. A segmentação permite focar em um único plano fino do espécime sem interferência de imagens confusas que surgem em áreas acima ou abaixo do plano que está sendo focado.

A profundidade de um espécime é medida em uma direção paralela ao eixo óptico do microscópio. A focalização da imagem estabelece a distância correta entre o espécime e a imagem, permitindo que a interferência das ondas difratadas ocorra em um plano predeterminado (o plano da imagem) posicionado a uma distância fixa da ocular. Isso permite que objetos difratados que ocorrem em diferentes níveis de profundidade no espécime sejam vistos separadamente, desde que haja contraste suficiente.

Toda a profundidade de um espécime pode ser segmentada opticamente focando sequencialmente em cada plano sucessivo. Neste sistema, a profundidade do campo é a distância de um nível até o próximo onde ocorre a formação de imagem de detalhes distintos e é controlada pela abertura numérica da objetiva. Objetivas de abertura numérica mais alta exibem profundidades de campo muito rasas. O contrário vale para objetivas de abertura numérica mais baixa. A capacidade geral de uma objetiva de isolar e focar em uma seção óptica específica diminui à medida que a homogeneidade óptica do espécime diminui.

4. Visibilidade aprimorada.

Outra vantagem do contraste de modulação Hoffman é a visibilidade aprimorada. As imagens aparecem sombreadas ou pseudo-tridimensionais, aumentando a visibilidade devido às diferenças de contraste em ambos os lados de um detalhe. Também não há halos exibidos nas imagens, ao contrário das imagens produzidas com óptica de contraste de fase. O contraste de modulação Hoffman converte informações de gradiente de fase em diferenças de amplitude que são muito diferentes das variações de relação de fase (e diferenças de trajetória óptica) produzidas por um microscópio de contraste de fase.

O uso das áreas escuras e cinzas no modulador produz imagens que contêm vários tons de cinza e são desprovidas de cor. É possível introduzir cores em imagens de contraste de modulação produzindo moduladores com as áreas cinzas e escuras substituídas por áreas coloridas de valores de transmissão iguais. Nesse caso, as imagens resultantes do gradiente de fase seriam renderizadas em cores com gradientes semelhantes na mesma tonalidade. Atualmente, não é conhecida nenhuma fonte comercial de filtros de modulação que contenham áreas coloridas.

Limitações do contraste de modulação Hoffman

Existem também várias desvantagens e limitações do contraste de modulação Hoffman Em primeiro lugar, essas imagens devem ser vistas com cuidado. O motivo é que diferentes observadores podem ver uma "colina" na imagem como um "vale" ou vice-versa, uma vez que a imagem pseudo-tridimensional é observada através da ocular. O sistema também é altamente sensível a gradientes perpendiculares ao comprimento da fenda. Como resultado, esta técnica requer algum grau de habilidade para posicionar o espécime para se ter o melhor efeito.

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