A microscopia de campo escuro é uma técnica que aproveita a iluminação oblíqua para aumentar o contraste em amostras que não são bem visualizadas em condições normais de iluminação.

Depois que a luz direta foi bloqueada por uma parada opaca no condensador, a luz que passa pela amostra a partir de ângulos oblíquos é difratada, refratada e refletida na objetiva do microscópio para formar uma imagem brilhante da amostra sobreposta em um fundo escuro.

Esse fundo escuro fornece um alto grau de contraste e pode fazer com que amostras com fundos difíceis se destaquem com relativamente pouco esforço. Confira alguns exemplos nas imagens abaixo.

À direita: espiráculo de larva de bicho-da-seda e traqueia. Pequenos pedaços de madeira fragmentada adquirem uma aparência incomumente bonita quando iluminados em condições de campo escuro com um microscópio de luz transmitida.

Esquerda: borboleta. As borboletas, devido ao amplo espectro de padrões de escala de asas exibidos por membros dessa ordem, são um dos membros mais coloridos do mundo dos insetos. A imagem digital mostra as muitas escalas em miniatura que decoram a maior parte da superfície da asa de uma borboleta. As escamas das asas foram iluminadas com um condensador de campo escuro e capturadas em baixa ampliação (50x).

Como funciona a microscopia de campo escuro?

A iluminação de campo escuro requer o bloqueio da maior parte da luz que normalmente passa através e ao redor do espécime, permitindo que apenas raios oblíquos interajam com o espécime.

A lente superior de um condensador de campo escuro Abbe simples é esfericamente côncava, permitindo que os raios de luz emirjam da superfície da lente superior para formar um cone de luz oco invertido com o foco centralizado no plano da amostra. Em locais onde não há amostra e a abertura numérica do condensador é maior que a da objetiva, os raios oblíquos se cruzam e perdem a objetiva, deixando essas áreas escuras.

Quando um espécime (especialmente um não tingido e não absorvente de luz) é colocado em uma lâmina, os raios oblíquos interagem com o espécime e são difratados, refletidos e/ou refratados por elementos na amostra, como a membrana celular, núcleo, e organelas internas. Isso permite que esses raios fracos entrem na objetiva. O resultado é um espécime brilhante em um fundo preto.

Quais componentes são necessários para a microscopia de campo escuro?

Quase qualquer microscópio de laboratório de campo claro pode ser facilmente convertido para realizar a iluminação de campo escuro. A maneira mais fácil de fazer isso é trocar seu condensador atual por um que seja projetado para iluminação de campo escuro (Figura 1).

Esses condensadores são relativamente simples e oferecem a alta abertura numérica (NA) necessária para criar o cone de iluminação necessário para o campo escuro. No entanto, alternar condensadores com base no tipo de iluminação é impraticável para o uso diário do microscópio. Felizmente, há uma solução alternativa.

Muitos condensadores podem acomodar inserções que podem criar um cone de iluminação. Essas inserções não oferecem um NA tão alto quanto um condensador de campo escuro dedicado, portanto, nem todas as objetivas podem ser usadas. No entanto, as inserções fornecem a flexibilidade de ter vários métodos de observação no mesmo condensador.

Figura 1. Condensador projetado para iluminação de campo escuro

Por que a microscopia de campo escuro é uma boa técnica de geração de imagens?

Em geral, os objetos fotografados sob as condições adequadas de iluminação de campo escuro são espetaculares de se ver. Frequentemente, as amostras contendo contraste inerente muito baixo em microscopia de campo claro brilham intensamente em campo escuro.

A iluminação de campo escuro é melhor para revelar contornos, arestas, limites e gradientes de índice de refração. Entre os candidatos ideais para iluminação de campo escuro estão minúsculos organismos aquáticos vivos, diatomáceas, pequenos insetos, ossos, fibras, cabelo, bactérias não coradas, leveduras, células em cultura de tecidos e protozoários.

As amostras não biológicas incluem cristais minerais e químicos, partículas coloidais, amostras de contagem de poeira e seções finas de polímeros e cerâmicas contendo pequenas inclusões, diferenças de porosidade ou gradientes de índice de refração.

Aqui estão alguns exemplos de espécimes capturados usando imagens de campo escuro:

Esquerda: esta espetacular fotomicrografia de campo escuro da diatomácea Arachnoidiscus ehrenbergi foi capturada em um microscópio Olympus por Mortimer Abramowitz. A amostra foi iluminada com um condensador de campo escuro de alta abertura numérica com óleo de imersão colocado entre a lâmina de microscópio e a objetiva e as lentes frontais do condensador. Meio: basswood. Os espécimes tingidos costumam ser excelentes candidatos para a microscopia de campo escuro, produzindo belas imagens reproduzidas em cores em um fundo escuro. Esta fotomicrografia ilustra uma seção delgada manchada de uma árvore de basswood sob iluminação de campo escuro. À direita: DNA líquido-cristalino. Esta solução de DNA altamente concentrada passou por uma série de transições de fase líquido-cristalina para formar uma fase hexagonal densamente compactada. Esta fotomicrografia foi tirada usando um microscópio óptico composto com uma objetiva de 10x em iluminação de campo escuro.

Infelizmente, a iluminação de campo escuro é menos útil para revelar detalhes internos. Existem também outras condições a serem consideradas se você deseja aproveitar ao máximo a iluminação de campo escuro.

Quais são os desafios do uso da microscopia de campo escuro?

Deve-se ter cuidado ao preparar as amostras para microscopia de campo escuro porque as características que ficam acima e abaixo do plano de foco podem dispersar a luz e contribuir para a degradação da imagem. A limpeza da lâmina é um fator importante durante a geração de imagens, mas é ainda mais importante em campo escuro, uma vez que cada pedaço de detrito será iluminado e pode prejudicar o que você está tentando ver.

Outros desafios que você pode enfrentar ao configurar um microscópio para campo escuro incluem:

• Iluminação insuficiente para tornar a amostra visível, ou a amostra está visível, mas muito fraca.

  A microscopia de campo escuro leva muita luz para criar uma imagem adequada porque grande parte dela está bloqueada para formar o cone. Portanto, não hesite em aumentar a energia, mas esteja ciente de que algumas amostras podem não gostar dessa quantidade de luz por períodos prolongados de tempo.

• A lâmina tem uma mancha escura no centro do campo de visão, mas os objetos na periferia são bem iluminados e parecem normais.

  Isso normalmente é causado quando o condensador está mal alinhado ou focado. Centralizar e focar o condensador resolverá esse problema. Esta solução se aplica à maioria dos problemas em que a iluminação parece irregular, mas a amostra está em foco.

• As cores aparecem no plano de fundo ou o plano de fundo é iluminado de forma irregular com um tom cinza.

  Isso geralmente é o resultado de a amostra ser muito espessa ou montada em meio contaminado. A remontagem da amostra deve ajudar.

Quais são as vantagens de usar a microscopia de campo escuro?

A microscopia de campo escuro tem muitas vantagens. Seu fundo escuro oferece um alto grau de contraste, facilitando a visualização de amostras em fundos difíceis. Esta técnica é facilmente acessível, uma vez que muitos microscópios de laboratório de campo claro podem ser configurados para iluminação de campo escuro. Além dos benefícios da microscopia, as imagens de campo escuro podem até parecer obras de arte com a amostra lindamente iluminada.

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