Em 2014, o Prêmio Nobel de Química foi atribuído a três cientistas “pelo desenvolvimento da microscopia de fluorescência de superresolução.” Como resultado, a indústria de microscópios foi alvo de um aumento de interesse significativo em técnicas de microscopia de superresolução ao longo dos últimos cinco anos.
Para aqueles que desconhecem o termo, microscopia de superresolução se refere a qualquer técnica óptica usada para ver amostras em uma resolução superior comparando com o limite da difração dos microscópios de luz convencionais.
A publicação de hoje do blog analisará a microscopia de superresolução pormenorizadamente. Saiba mais sobre as limitações dos microscópios de superresolução e descubra formas de permitir superresolução no seu sistema de microscópio existente.
As limitações dos microscópios de superresolução
Atualmente, quase todos os fabricantes de microscópios comerciais oferecem microscópios de superresolução. Estes microscópios são quase tão fáceis de usar como um microscópio confocal comum, mas nem sempre foi assim. Demorou vários anos para criar microscópios de superresolução fáceis de usar que não exijam especialistas que saibam usá-los e alinhá-los.
No início, a superresolução foi alvo de muito interesse por parte da comunidade científica. Porém, o interesse diminuiu à medida que os pesquisadores tiverem conhecimento do esforço necessário para realizar estes experimentos. Os resultados não compensavam o esforço de modificar a preparação da amostra, alterar os meios de formação de imagem ou realizar tarefas monótonas como alinhamento do índice de refração.
Será que os microscópios confocais conseguem realizar formação de imagem de superresolução?
Está bem estabelecido que a redução do tamanho do furo para pino abaixo de 1 AU em microscópios confocais permite uma resolução superior.
Em teoria, isso permitiria obter o aumento de 2x mais resolução que geralmente define a superresolução. No entanto, na prática, verificou-se que a resolução somente pode ser melhorada em aproximadamente 1,4x porque os sinais de alta frequência são fracos quando comparados com os vários sinais de baixa frequência.
Consequentemente, os esforços se concentraram no modo como a tecnologia existente, como o microscópio confocal, podia ser melhorada para usar informações espaciais de alta frequência já presentes nessas imagens. Naturalmente, surgiu a ideia da deconvolução.
Como funciona a deconvolução?
Os algoritmos de deconvolução devolvem fótons fora de foco às suas posições originais, com base em uma função de expansão de pontos (PSF) teóricos ou adquiridos para aumentar a nitidez e clareza das imagens adquiridas.
Na realidade, os algoritmos de deconvolução podem reduzir o tamanho de uma esfera fluorescente com sub-resolução em largura à meia altura (FWHM) para alcançar um aumento 2 vezes superior medido em resolução no campo amplo.
Vamos voltar atrás por um momento e definir resolução no contexto da microscopia. Tradicionalmente, isso é definido usando o critério de Rayleigh, que especifica que deve existir um mínimo de 26% de redução na intensidade entre dois objetos para defini-los adequadamente como dois objetos separados.
Isso é mais comumente designado como resolução de dois pontos. A redução da FWHM de um objeto com sub-resolução através de deconvolução fornece imagens mais nítidas, mas isso poderá ser insuficiente para obter superresolução.
Se impõe a pergunta: a deconvolução é suficiente para fornecer dados de superresolução verdadeiros em amostras reais?
A resposta é não.
Um dos principais métodos de deconvolução linear é o filtro de Wiener. O filtro de Wiener lida com todos os dados de alta frequência do mesmo modo, o que resulta em formação de artefatos de ressonância (ringing), conforme apresentado na figura abaixo:
Algumas pessoas podem argumentar que esses artefatos são minimizados modificando a intensidade do filtro ou escondendo-os totalmente dos pesquisadores. Porém, a realidade é que artefatos grandes não são aceitáveis ao observar estruturas abaixo do limite de resolução.
Com isso em mente, desenvolvemos a Olympus Super Resolution.
Obtenha imagens (super) nítidas com Olympus Super Resolution
O que é exatamente a Olympus Super Resolution? OSR é um processo de filtragem que amplifica ou atenua informações espaciais de alta frequência específicas para fornecer um resultado mais confiável.
Este processo pode ser associado a algoritmos de deconvolução para tornar as imagens de superresolução mais claras e nítidas.
Para saber como a Olympus Super Resolution pode ajudar a adquirir imagens nítidas no seu microscópio, entre em contato conosco agora mesmo!
