Em pesquisas médicas e de ciências da vida, experimentos em nível de célula e experimentos envolvendo modelos animais são muito importantes. A quantidade de estudos que observam a ecologia sob um microscópio aumenta a cada ano. Uma boa parte exige a formação de imagem intravital de intervalo de tempo de amostras vivas. Uma questão importante para os pesquisadores que fazem essas formações de imagens intravital é a mudança do plano de observação devido à pulsação dos órgãos e ao movimento do animal em si.
Além dos sistemas de microscópio padrão, trabalhamos com os clientes para criar soluções personalizadas. Aqui, apresentamos um exemplo: nosso dispositivo de fixação de ratos por adsorção, que desenvolvemos para ajudar a resolver problemas associados à formação de imagem intravital em camundongos.
Exemplo de um dispositivo personalizado de fixação de ratos por adsorção
Problemas para pesquisadores que realizam formação de imagens intravital de intervalo de tempo de longo prazo
Na formação de imagem intravital, o movimento da amostra e do plano de observação devido à pulsação dos órgãos dificulta os experimentos de intervalo de tempo. Entrevistamos pesquisadores que realizam experimentos de intervalo de tempo de longo prazo em camundongos vivos para obter uma melhor compreensão dos problemas que eles enfrentam. Aprendemos que:
- Em comparação com órgãos que podem ser retirados do corpo, como a aurícula e os intestinos, é difícil observar órgãos como o baço e o fígado.
- Órgãos próximos ao coração são particularmente suscetíveis à pulsação.
- Não são apenas movimentos de ordem milimétrica, como a pulsação, mas também movimentos sutis de ordem micrométrica que dificultam a observação.
Solução personalizada para problemas de formação de imagem intravital da EVIDENT
Para suprimir a pulsação dos ratos na superfície de observação, criamos um método que usa sucção para inibir fisicamente o movimento do animal milimetricamente. Nosso dispositivo tem um encaixe de metal em forma de rosca e uma bomba de sucção para elevar e fixar o local de observação com pressão negativa. Ao minimizar os movimentos da amostra, conseguimos suprimir a influência da pulsação elevada do coração.
Sistema de fixação por sucção que permite a observação de órgãos de ratos sem movimento
Resolvendo o problema secundário de retenção de líquidos de imersão suficiente
Objetivas de imersão são normalmente usadas para observação de intervalo de tempo de organismos vivos. Entretanto, apenas uma pequena quantidade de líquido de imersão pode ser retida na superfície de observação devido à tensão da superfície. Além disso, ao tentar reabastecer o líquido de imersão durante o experimento, problemas como mudanças de temperatura e pressão física fazem com que a superfície e a parte de observação se desalinhem. Para resolver esses problemas, também fornecemos um mecanismo no dispositivo de fixação de ratos por adsorção que pode armazenar líquido de imersão suficiente para observação de longo prazo. Esse mecanismo permite que os pesquisadores realizem observações de longo prazo sem precisar reabastecer o líquido de imersão.
Sem o nosso dispositivo de fixação de ratos por adsorção, os pesquisadores eram forçados a fixar o corpo vivo através do método de tentativa e erro em cada experimento. Com este dispositivo, agora é possível realizar observações estáveis de intervalo de tempo de longo prazo enquanto mantém a atividade biológica.
Veja a solução em ação: assista a estes vídeos de exemplos de formação de imagem intravital de intervalo de tempo
Veja você mesmo como o dispositivo de fixação de ratos por adsorção funciona; assista a esses vídeos de intervalo de tempo capturados em colaboração com o Laboratório Matsuda da Universidade de Quioto.
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Observação do movimento das células linfáticas devido a danos por ablação a laser em linfonodos por microscopia multifóton
Este experimento de intervalo de tempo envolveu a observação da atividade de ERK em células hepáticas usando FRET (CFP-YFP). A atividade elevada de ERK é mostrada em vermelho e a atividade reduzida de ERK é mostrada em azul. 30 minutos após o início da aquisição das imagens, as células de Kupffer, que foram danificadas pelo laser e que são células linfoides, se acumulam no local inflamatório.
- Condições de aquisição de imagem
- Amostra: rato Eisuke
- Objetiva: XLPLN25XWMP
- Laser: 840 nm
- Zoom: 1x (esquerda), 3x (direita)
- Posição z: 0 µm(parte inferior), 20 µm(parte superior)
- Intervalo: 40 s.
- Tempo total do experimento: aproximadamente 2,5 horas
Este vídeo registrou a observação de intervalo de tempo da atividade de ERK nos gânglios linfáticos por FRET (CFP-YFP). A atividade elevada de ERK é mostrada em vermelho e a atividade reduzida de ERK é mostrada em azul. 30 minutos após o início da aquisição da imagem, ocorreu o dano do laser e, imediatamente após isso, as células linfoides ao redor da área danificada pararam de se mover.
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Este vídeo registrou a observação de intervalo de tempo da atividade de ERK nos gânglios linfáticos por FRET (CFP-YFP). A atividade elevada de ERK é mostrada em vermelho e a atividade reduzida de ERK é mostrada em azul. 30 minutos após o início da aquisição da imagem, ocorreu o dano do laser e, imediatamente após isso, as células linfoides ao redor da área danificada pararam de se mover.
- Condições de aquisição de imagem
- Amostra: rato Eisuke
- Objetiva: XLPLN25XWMP
- Laser: 840 nm
- Intervalo: 30 s.
- Tempo total do experimento: aproximadamente 1 hora
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Observação da atividade de ERK em células pancreáticas por microscopia multifóton
Nesta captura de intervalo de tempo, a atividade de ERK foi observada usando FRET (CFP-YFP). A atividade elevada de ERK é mostrada em vermelho e a atividade reduzida de ERK é mostrada em azul. Este foi um experimento de controle para validar que as condições de formação de imagem não alteram a atividade de ERK. Como não houve alteração mesmo após 3 horas de observação, podemos concluir que não há efeito na atividade de ERK, mesmo se observado durante a aspiração com um fixador.
- Condições de aquisição de imagem
- Amostra: rato Eisuke
- Objetiva: XLPLN25XWMP
- Laser: 840 nm
- Posição z: 0 µm (esquerda), 7.5 µm (centro), 15 µm (direita)
- Intervalo: 2 min.
- Tempo total do experimento: aproximadamente 3 horas
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Além deste dispositivo de fixação de ratos por adsorção, a Evident oferece outras soluções estendidas para sistemas padrão com tecnologia avançada de microscopia. Entretanto, essas soluções personalizadas não estão disponíveis em alguns países ou regiões. Saiba mais na nossa página de Soluções personalizadas.
*O dispositivo de fixação de ratos por adsorção é um produto que usa nossa tecnologia patenteada (Patente Nº 6037732).
**Essas imagens e vídeos de microscópio neste post de blog foram feitos usando camundongos que expressa sondas FRET com a cooperação do Laboratório Matsuda da Universidade de Quioto.
