À medida que mais funcionários do laboratório trabalham de casa para respeitar o distanciamento social, os funcionários estão usando plataformas de tecnologia da informação de trabalho remoto para se comunicarem e se manterem produtivos. Mas essa mudança na forma como os cientistas e funcionários do laboratório trabalham significa que os laboratórios devem adaptar seus métodos para usufruir totalmente das plataformas remotas. Se você não sabe por onde começar, este blog pode ajudá-lo.

Aqui estão seis dicas para ajudá-lo a implementar com sucesso a microscopia remota:

1. Determine as plataformas de TI disponíveis em seu laboratório.

Seus recursos de operação remota dependem fortemente da infraestrutura de TI em seu laboratório.

Durante o planejamento da microscopia remota, primeiro confirme quais ferramentas de reunião na Web ou software podem ser usados, e se o seu instituto tem restrições de rede e quaisquer outras considerações de infraestrutura de TI.

Verifique também se não ocorrerá interrupções inesperadas do software. Por exemplo, a atualização do Windows pode ser executada durante a noite, exigir uma reinicialização e impactar a operação remota. Embora você deva seguir sua política de TI local, desativar a atualização pode evitar esse problema.

2. Projete sua observação microscópica identificando seus recursos remotos atuais.

A próxima etapa é planejar e projetar sua observação remota, identificando o que pode ser feito remotamente e o que deve ser feito no local.

Isso pode depender do seu microscópio e do seu experimento. Com microscópios totalmente motorizados, geralmente você pode ir embora depois de configurar a observação, mas tenha em mente o seguinte:

• O que devemos fazer localmente: configuração e foco da amostra, colar de correção, aplicação de óleo, se necessário, e configuração de um ambiente remoto
• O que podemos fazer remotamente: operação após configuração aproximada de foco, ajustes finos para observação e análise ou compartilhamento de imagens

Mesmo se o seu sistema não puder realizar monitoramento ou operação remota, vale a pena estudar as opções que os fornecedores oferecem.

Por exemplo, a maioria dos microscópios profissionais tem design modular e podem ser atualizados para um sistema motorizado. Além disso, hoje existem muitas ferramentas dedicadas à microscopia e plataformas gerais de reunião na Web para monitoramento remoto, compartilhamento de imagens ou operação de microscópio.

Em geral, não recomendamos o uso de óleo para observação remota porque pode ser complicado trabalhar a distância. Não pode ser aplicado remotamente e pode causar problemas de qualidade de imagem e pode danificar sua óptica se for aplicado com frequência ou se não for limpo corretamente após o uso. No entanto, uma exceção é usar um escâner de lâminas de pesquisa que aplica o óleo automaticamente. E para aqueles que estão familiarizados com o uso de óleo, pode ser considerada a pré-lubrificação (aplicação de óleo antes do início do experimento).

Figura 1. Orientação geral sobre quais tarefas de microscopia remota devem ser realizadas no local. Observe que a condição de iluminação pode ser controlada remotamente dependendo da configuração do microscópio.

3. Ajuste a parfocalidade.

Raramente percebemos a importância do ajuste da parfocalidade quando observamos através de uma ocular, uma vez que é tão fácil e rápido ajustar o foco fino após girar as objetivas. Mas ao fazer microscopia remota, a parfocalidade entre diferentes ampliações torna-se um componente crítico para uma observação uniforme.

Com a configuração de parfocalidade perfeita, você não precisará reajustar o foco ao alternar as ampliações. Consulte nosso guia de procedimento rápido para ajuste de parfocalidade com uma câmera. Como descreve o guia, é importante ajustar a parfocalidade por meio das oculares antes de ajustar a parfocalidade da câmera.

4. Verifique o nivelamento da platina.

O nivelamento da platina não pode ser corrigido remotamente e pode fazer com que você perca o foco na amostra se ele for negligenciado. A boa notícia é que verificar o nivelamento da platina é fácil. Basta mover a platina na direção XY com alta ampliação, que possui uma profundidade focal rasa (explicada posteriormente), quando você estiver em seu laboratório.

Se o nivelamento da platina não for garantido, o plano focal pode deslocar contra o plano Z da amostra e, eventualmente, perder o foco na amostra durante o trajeto XY. Embora algumas inserções de platina de terceiros tenham parafusos niveladores de ajuste, o suporte da Olympus foi projetada para fornecer uma plataforma plana sem ajustes.

5. Siga as práticas recomendadas para foco remoto em microscopia.

Focar é uma das operações remotas mais desafiadoras e, para piorar as coisas, é irreversível se a amostra sofrer uma colisão com a objetiva e danificar sua amostra ou óptica. Mesmo na melhor das hipóteses, em que a amostra cai do suporte de amostra de um microscópio invertido, esse problema não pode ser corrigido remotamente.

Então, como você pode evitar esses eventos? Siga estas cinco regras gerais para foco remoto:

• Monitoramento cuidadoso: Isto é mais fácil de falar do que fazer. Os gargalos críticos são a taxa de quadros da imagem ao vivo e o atraso do movimento Z real. No entanto, existem algumas maneiras de melhorá-los. Primeiro, o binning ou subamostragem da configuração de aquisição de imagem é uma maneira geral de melhorar a taxa de quadros. A taxa de quadros e o atraso também podem ser limitados pela ferramenta de webconferência que você está usando. Algumas ferramentas de webconferência possuem um menu de configurações para ajustar a qualidade e velocidade da imagem. Recomendamos que você priorize a velocidade, principalmente ao pesquisar o plano focal.
• Use uma abordagem passo a passo com uma maior profundidade de campo: Esta abordagem pode ajudá-lo a evitar a situação em que todas as imagens estão fora da profundidade de campo e de você não conseguir ver nada. Se uma imagem estiver muito desfocada, pode ser impossível avaliar se você deve mover o foco para cima ou para baixo. Por esse motivo, evite perder o foco no alvo fora da profundidade de campo. A profundidade de campo é determinada com a abertura numérica (NA). Uma objetiva com alta abertura numérica tem uma profundidade de campo rasa. Portanto, recomendamos que você ajuste o foco começando com AN baixo para AN alto, geralmente de baixa ampliação para alta ampliação. Ao usar um microscópio confocal, a analogia semelhante de “profundidade de campo mais profunda” pode ajudar. Como uma abertura confocal menor leva a uma profundidade de campo mais rasa, tente uma abertura mais ampla para identificar e focar no alvo quando você não consegue encontrar a amostra ou a amostra está muito fraca. Após a focalização precisa, defina a confocalidade apropriada e a potência do laser para a aquisição da imagem.
  

  Figura 2. (Esquerda) Objetivas de baixa ampliação geralmente têm uma AN baixa e ampla profundidade de campo, o que torna visível o intervalo Z mais amplo. (Direita) Objetivas de alta ampliação com alta AN têm uma profundidade de campo rasa. Isso pode ajudá-lo a ver apenas as amostras em foco, mas corre-se o risco de perder o foco.

• Abordagem de longe: Como mencionado acima, colidir com sua amostra é o pior cenário que você deve sempre tentar evitar, por isso é importante abordar com cuidado à distância. Se você estiver usando um microscópio invertido, faça a aproximação pelo lado inferior. Para microscópios verticais, faça a aproximação pelo lado superior. Quando você move XY drasticamente, vale a pena mover a objetiva antes de mover a platina.
  

  Figura 3. (Esquerda) Aproxime as amostras do lado inferior para microscópios invertidos e (direita) do lado superior para microscópios verticais.

• Imagine a forma 3D da amostra: Sua amostra pode não existir no mesmo plano Z em diferentes posições XY, e você pode perder o foco na amostra ao se mover para muito longe. Isso pode ser causado pela própria amostra ou pelo nivelamento da platina, conforme mencionado acima. Ao usar uma objetiva de alta AN com uma profundidade de campo rasa, é melhor mover o XY ligeiramente e ajustar o Z com cuidado, não percorrendo muito sem focalizar simultaneamente. Quando você perder o foco, mude para uma configuração de profundidade de campo mais ampla, se possível. Se estiver criando uma imagem lado a lado, o mapa de foco pode ajudá-lo a definir as informações de altura do foco.
  

  Figura 4. Se as amostras não existem no mesmo plano Z, perdemos o foco quando fazemos movimentos muito longos (a). Nesse caso, precisamos reajustar o foco (b) ou tentar outra objetiva

• Lembre-se do limite de foco: Para proteger sua amostra e equipamento, um limite de foco pode ser aplicado. Para aqueles que não estão familiarizados, o recurso de limite de foco limita a faixa móvel de Z. Normalmente, você não precisa alterar o limite de foco. Mas se alguém mudou a configuração ou se você está usando uma amostra excepcionalmente espessa, como um recipiente com fundo alto, o recurso de limite de foco pode impedi-lo de chegar perto o suficiente de sua amostra para observação. Observe que a configuração do limite de foco só pode ser feita localmente, pois precisamos observar a distância física entre uma objetiva e uma amostra.

Embora tenhamos descrito dicas para foco remoto aqui, outra boa abordagem é automatizar o foco. Você pode aprender mais sobre o foco automatizado em nossa postagem do blog “Quatro dicas para obter imagens de células vivas mais longas com menos tempo no laboratório”.

6. Use um mapa para identificar a posição XY.

Outro desafio da observação remota é que você pode perder a noção de onde está observando. Isso é causado pela combinação de uma taxa de quadros limitada, atraso na imagem ao vivo, FOV limitado e falta de visibilidade direta na platina do microscópio.

Uma solução útil é usar um mapa. Com uma configuração da platina motorizada, você pode facilmente criar um mapa com baixa ampliação. Vale a pena investir um pouco mais de tempo para criar um mapa, pois ele pode permitir que você identifique imediatamente e continuamente onde está observando e, mais importante, você pode pular para qualquer lugar que quiser apenas clicando em uma posição no mapa.

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