A formação de imagem de fluorescência exige um equilíbrio delicado. Por um lado, você precisa adquirir um sinal alto o suficiente, o que pode ser alcançado usando um tempo de exposição mais longo ou uma luz de excitação mais forte. Por outro lado, você precisa minimizar a fototoxicidade para a condição da amostra reduzindo o tempo e a intensidade da excitação.
Descubra como alcançar este equilíbrio com estas melhores práticas para câmeras para microscópio.
1. Use um histograma.
Um histograma pode ajudá-lo a determinar o tempo de exposição ideal. Em resumo, o histograma é um gráfico que indica a distribuição do nível do sinal. O eixo X do histograma é a intensidade do sinal. Os dados são distribuídos a partir do zero até o nível de sinal máximo da câmera. A altura do histograma em cada valor X exibe o número de píxeis para a intensidade do sinal, tal como mostrado na Figura 1 abaixo.
Figura 1: um histograma de uma imagem. (a) Imagem original, (b) intensidade do sinal de cada píxel mostrado na imagem original, (c) um histograma criado com base na imagem original.
A forma e a distribuição do histograma nos indicam se o tempo de exposição atual é adequado. Na maioria dos casos de formação de imagem de fluorescência, a maioria dos píxeis são um fundo escuro sem sinal, o que leva a um pico ao redor do nível de fundo.
Se o histograma estiver muito cheio em uma faixa de sinal baixa, o tempo de exposição será muito curto (Figura 2, meio). Se houver uma queda acentuada no nível máximo do sinal, o valor do sinal será saturado (Figura 2, à direita). Nesse caso, você pode reduzir a intensidade da excitação ou diminuir o tempo de exposição.
Figura 2: um histograma com exposição normal (esquerda), subexposição (meio) e superexposição com saturação no marcador amarelo (direita).
2. Combine a faixa dinâmica da tela com a faixa dinâmica de dados.
Alguns softwares de aquisição de imagem possuem um recurso de ajuste automático da tela que fornece melhor visibilidade e mantém os dados originais da imagem, simultaneamente definindo a ligação entre a intensidade do sinal e o brilho da tela.
Combinar o intervalo dinâmico da tela com o intervalo dinâmico de dados (o nível do plano de fundo no sinal mais claro) permite que você obtenha melhor visibilidade enquanto mantém os dados da imagem original (Figura 3, direita). Um histograma ajuda a ilustrar esse ajuste.
Figura 3: ajuste da tela. (a) Configuração original. O brilho do sinal exibido é muito mais escuro que a faixa dinâmica da tela (255). (b) Condição da tela ajustada.
Agora que abordamos algumas dicas e ferramentas úteis de câmeras para microscópios, vamos colocá-las em prática. A nossa próxima seção resume um fluxo de trabalho passo a passo simples que pode ajudá-lo a definir as configurações de aquisição de imagem mais adequadas para formação de imagem de fluorescência.
Seis passos para configurar os parâmetros de aquisição de uma câmera para microscópio
Veja a seguir seis passos gerais para configurar adequadamente uma câmera para microscópio para experimentos de formação de imagem de fluorescência. Observe que o melhor procedimento depende da sua aplicação específica e amostras.
- Determine a ampliação da observação.
- Ajuste o foco na sua amostra e encontre o alvo da observação. O ajuste automático da tela é recomendado. Quando você não estiver observando uma imagem real ou tirando uma foto, feche o obturador de fluorescência.
- Defina a configuração da câmera para aquisição de imagem (por ex. resolução, tempo de exposição).
- Experimente a intensidade da excitação de luz mais fraca e estenda o tempo de exposição até que consiga obter o sinal maior que o ruído de fundo.
- Se o tempo de exposição for impraticavelmente longo, experimente uma excitação mais forte passo a passo.
- Verifique o histograma para confirmar que não há saturação.
Lembre-se de que esta é uma breve lista de melhores práticas. Para obter instruções mais detalhadas sobre formação de imagem digital, certifique-se de verificar o nosso livro branco Compreendendo a ligação entre dados de imagens digitais e amostras biológicas.
Sempre leve em consideração a sua amostra e aplicação para a formação de imagem de fluorescência
Em última análise, a melhor configuração de aquisição de imagem depende da sua amostra e aplicação. Se a sua amostra for delicada, você pode precisar usar uma excitação fraca. Por outro lado, aplicar uma exposição mais curta com uma excitação relativamente forte pode funcionar melhor quando você precisa capturar fenômenos rápidos. De qualquer forma, o ajuste do histograma e da tela pode ajudá-lo a determinar a condição de aquisição ideal.
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