Fatias cerebelares organotípicas de camundongo recuperadas por 7 dias após a desmielinização. Os axônios são vistos com neurofilamento H em verde, a mielina é marcada com proteína básica de mielina em vermelho e o GSTpi é corpo celular de oligodendrócito marcado em azul. Amostras de Katherine Given, MS, Universidade de Colorado, Denver. Capturado a 20× no escâner de lâminas de pesquisa SLIDEVIEW VS200 com o módulo SILA.
 

Os microscópios de fluorescência de campo amplo oferecem formação de imagem de alta resolução para amostras finas. Mas, quando se trata de amostras espessas, os microscópios de campo amplo têm uma limitação na capacidade de formação de imagem devido à falta de nitidez causada pela fluorescência de fundo.

Como resolver esse problema em amostras espessas? A resposta está no seccionamento óptico. Esse método supera com eficácia as limitações da formação de imagem de campo amplo, mas costumava exigir um sistema confocal ou software para tratamento de imagem.

Atualmente, a tecnologia de seccionamento óptico está presente em escâneres de lâminas de pesquisa. Isso significa que os pesquisadores podem aproveitar os recursos confocais para formação de imagem de amostras espessas, com aumento significativo na produtividade operacional. Veja em detalhes como exploramos as vantagens desse método de seccionamento óptico nesta comparação com as técnicas tradicionais.

Quais são as limitações da formação de imagem de campo amplo em amostras espessas?

A microscopia de campo amplo é uma técnica comum de formação de imagem altamente eficaz em amostras finas (<10 µm). Na microscopia de campo amplo, a luz dos planos em foco e fora de foco são capturados pela câmera. Isso não é um problema em amostras finas. Ao formar imagens de amostras mais espessas essa fluorescência de fundo inevitável causa borrões na imagem e contraste ruim, que obscurecem as estruturas de interesse.

A microscopia confocal e outros métodos de iluminação de escaneamento podem superar esse problema. Eles modelam a iluminação em um padrão fixo, que resulta em uma imagem opticamente seccionada. Esses sistemas podem produzir imagens excelentes sob condições favoráveis. Ainda assim, isso tem um custo significativo. Eles também dependem de que a amostra receba padrões de iluminação controlados e bem definidos.

Apresentamos uma abordagem de iluminação diferente para capturar imagens de amostras espessas

Para cancelar os efeitos da fluorescência de fundo no contraste e na qualidade da imagem, padrões bem-definidos e controlados de iluminação nem sempre são necessários. Nossa técnica, conhecida como microscopia HILO, usa padrões de manchas aleatórias para iluminar a amostra fluorescente. Os padrões de manchas exibem intensidade granular com contraste alto inerente, fazendo com que as imagens de fluorescência obtidas por iluminação de manchas pareçam granulares. Essa granularidade oferece contraste e uma indicação direta do nível de focalização da amostra.

Durante a formação de imagem HILO, duas imagens brutas são coletadas e processadas. A primeira é uma imagem de campo amplo regular com iluminação uniforme. Um filtro passa-alta é aplicado a essa imagem para extrair informações de alta frequência, a parte "HI" (alta) do acrônimo HILO. Essa etapa elimina informações de baixa frequência, incluindo informações em foco e fora de foco.

A segunda imagem é capturada com iluminação de manchas para recuperar a baixa frequência nas informações de imagem em foco. Em outras palavras, a parte "LO" (baixa) da microscopia HILO. Para processar essas imagens, é usado um algoritmo que extrai informações em foco e elimina a fluorescência de fundo. As duas imagens são fundidas (Figura 1) para se obter uma imagem que contém informações de toda a faixa de frequências, com a remoção da luz fora de foco.

O dispositivo de seccionamento óptico SILA é uma solução de formação de imagem de alta produtividade operacional para nossos escâneres de pesquisa SLIDEVIEW™ VS200 baseada em microscopia HILO. É uma tecnologia complementar para microscópios de campo amplo que elimina a luz fora de foco. Notavelmente, ela produz um seccionamento óptico nítido equivalente à microscopia confocal. O dispositivo SILA pode ser adicionado facilmente a qualquer sistema VS200. Ele beneficia uma grande variedade de aplicações que exigem formação de imagem óptica de alta qualidade para amostras mais espessas.

Figura 1. Seção de rim de rato com aumento de 20×. O dispositivo SILA no escâner VS200 combina uma imagem com iluminação uniforme e uma com iluminação de manchas para fornecer uma imagem combinada com seccionamento óptico nítido.
 

Seccionamento óptico ajustável usando um parâmetro

Como o dispositivo SILA processa matematicamente a imagem de campo amplo tradicional e a imagem de manchas, é possível ajustar o grau de seccionamento óptico usando o parâmetro único de espessura de seccionamento (ST). Se o valor da ST for alto, as imagens mostram informações de uma profundidade de campo maior. Isso cria a aparência de uma imagem de campo amplo.

A Figura 2 mostra a seção de cérebro tirada no ST5. Nesse valor alto de ST, muitas áreas fora de foco permanecem. À medida que o valor de ST diminui, a imagem mostra informações de uma profundidade de campo menor. Então, ao observar a seção de cérebro tirada em ST2 e ST1, as informações em foco permanecem enquanto que os elementos fora de foco despareceram.

A capacidade de otimizar o seccionamento óptico dessa maneira permite, ao mesmo tempo, ver diferentes profundidades e remover a fluorescência de fundo. Esse recurso do dispositivo SILA para o escâner VS200 é comparável aos sistemas de microscópio confocais, em que a alteração do tamanho do pinhole causa um efeito semelhante.

Figura 2. Amostra de cérebro de camundongo marcada com tdTomato, capturada em 20×.
 

Remoção de borrões em amostras finas: comparação da formação de imagem SILA com outras técnicas

Antes do desenvolvimento do dispositivo SILA, os escâneres VS200 tinham uma solução alternativa para remover luz fora de foco de imagens de campo amplo. Com o software de deconvolução TruSight™, é possível fazer a deconvolução de imagens com algoritmos iterativos restritos (CI) bidimensionais. Essa abordagem de software funciona bem para remover parte da luz fora de foco. Mesmo assim, ela não remove grande parte dessa luz nem oferece a otimização de seccionamento óptico da combinação de software e hardware usada no módulo SILA.

No entanto, a deconvolução oferece uma opção intermediária viável para ver amostras mais finas, quando o seccionamento óptico SILA estiver indisponível. As diferenças na qualidade de imagem entre o campo amplo tradicional, deconvulado por software e imagens SILA são mostradas na Figura 3.

Figura 3. Planária Schmidtea mediterranea em aumento de 20×, mostrando os intestinos. Azul: DAPI. Verde: células internas do intestino. Vermelho: células externas do intestino. Amostras de Amrutha Palavalli, Departamento de dinâmica e regeneração de tecidos, Instituto Max Planck, Göttingen, Alemanha.
 

Aplicações de formação de imagem SILA: de camadas de células espessas a amostras de tecido

A tecnologia de seccionamento óptico SILA pode trazer valor significativo a muitas aplicações de pesquisa, especialmente na formação de imagem de amostras de camadas e tecidos de células espessas e fixadas. Com recursos de otimização de seccionamento, além de eliminação de borrões e contraste de imagem comparáveis ao de microscópios confocais, o SILA oferece formação de imagem de alta qualidade com grande melhoria de produtividade operacional.

A capacidade para formação de imagem de amostras mais espessas é uma vantagem no campo da neurociência, em que seções espessas de tecido são normalmente necessárias para preservar a morfologia do espécime. Formar imagens de seções cerebrais é reconhecidamente desafiador. Essa dificuldade é especialmente devida à propensão do tecido cerebral de produzir um efeito de dispersão de luz.

Tradicionalmente, os sistemas de microscopia confocal ou de dois fótons seriam necessários para capturar uma imagem de alta qualidade e alto contraste. Ainda assim, esses sistemas levam um tempo substancial para capturar uma imagem de uma área grande, como uma seção cerebral. O escaneamento de lâmina automatizado oferecido pelo sistema VS200 com dispositivo SILA torna a formação de imagem de amostras espessas em uma grande área muito mais rápida. O resultado é a obtenção de imagens de alta qualidade em um tempo muito menor (Figura 4).

Figura 4. Seção do cérebro de camundongo de 200 μm. Visão geral capturada a 4×. O escaneamento detalhado é uma imagem focal estendida (EFI) de uma série Z de 47 μm adquirida com aumento de 20×. Azul: DAPI. Verde: GFAP (glia). Amarela: MAP2 (neurônios).
 

A pesquisa de organoides também se beneficia da formação de imagem SILA, pois a formação de imagem nessa área apresenta desafios semelhantes aos da neurociência. A formação de imagem de organoides é complicada devido às amostras espessas, ao mesmo tempo que imagens de grandes áreas precisam ser capturadas para que a morfologia do organoide seja corretamente interrogada.

Como um escâner de lâminas inteiras, o sistema VS200 com módulo SILA pode oferecer a cobertura necessária para capturar a imagem dessas grandes amostras. Enquanto isso, o processamento de imagem automatizado, a função de dispersão de ponto (PSF) independente de amostra e o processo de trabalho simples resultam em aquisição rápida de imagens. O dispositivo SILA também beneficia a pesquisa de câncer, biologia espacial, botânica, embriologia e muitas outras aplicações que exigem formação de imagem de alta qualidade de amostras espessas em grandes áreas.

Tópicos principais sobre formação de imagem SILA

A formação de imagem SILA pode otimizar o seccionamento óptico, reduzir borrões na amostra e melhorar o contraste de imagem como microscópios confocais de escaneamento a laser sofisticados. O escâner de lâminas VS200 com dispositivo SILA oferece melhor produtividade operacional em relação aos sistemas confocais e permite formação de imagem rápida de amostras grandes e tradicionalmente difíceis para captura de imagens, beneficiando de forma significativa a neurociência, pesquisa de organoides e muito mais.

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