A formação de imagem multimodo e a fluorescência multiplexada tornaram-se métodos essenciais para examinar eficientemente diferentes elementos de amostras em um experimento. Porém, os resultados quantitativos deste experimento dependem de algo — a sua capacidade de extrair dados avançados de imagem.
A importância do escaneamento da lâmina inteira para quantificação
O princípio básico do escaneamento da lâmina inteira é montar digitalmente imagens de alta ampliação com um campo de visão pequeno em uma maior visão geral da amostra. Por que fazer isso?
De forma muito simples, a vantagem do escaneamento da lâmina inteira, chamado muitas vezes de escaneamento digital da lâmina ou microscopia virtual, é conferir um contexto biológico mais completo a uma imagem microscópica. Visualizar uma ou duas células isoladas em alta ampliação pode ser informativo, mas colocar essa célula no contexto mais alargado de tecidos completos oferece caminhos mais amplos de investigação.
Então, por que não simplesmente capturar uma imagem macro do tecido? O poder do escaneamento da lâmina inteira está na sua exibição de macro a micro, em que a resolução microscópica permite uma maior quantificação de imagens, seja contando núcleos através de um tecido ou rastreando axônios a grandes distâncias em um cérebro.
Devido a esta poderosa combinação de resolução e contexto biológico, o escaneamento da lâmina inteira automatizado se tornou o alicerce de muitos programas de pesquisa. Continue a ler para aprender mais sobre as suas poderosas capacidades de observação para a extração de novas informações das suas amostras.
Capacidades de formação de imagem em sistemas de escaneamento de lâmina inteira
Durante anos, os sistemas de escaneamento da lâmina inteira eram limitados nos seus modos de formação de imagem. Atualmente, os sistemas de escaneamento da lâmina inteira como o nosso escaneador de lâminas para pesquisa VS200 podem combinar múltiplos métodos de observação, permitindo que você veja estruturas que são visíveis somente em certas condições. Isso significa que você pode combinar métodos de observação, como:
- Campo claro: na formação de imagem de campo claro, uma luz branca transmitida atravessa a amostra e os tecidos são visualizados através de colorações cromogênicas. Contudo, o campo claro não fornecerá qualquer contraste inato, a não ser que você use colorações cromogênicas, como hematoxilina e eosina.
- Epifluorescência: permite a marcação específica de anticorpos e graus mais altos de direcionamento molecular. Também permite que um maior número de marcações seja sobreposto, o que expande o campo de multiplexagem.
- Contraste de fase e polarização: é possível incluir óptica de fase e polarização em imagens de lâmina inteira e obter vários níveis de contraste inato com base em iluminação anelar de fase ou luz polarizada.
- Campo escuro: usa as diferenças do índice de refração em estruturas de membranas no tecido. Ainda que algumas colorações possam aprimorar o campo escuro, a técnica pode ser completamente isenta de marcadores e proporcionar um nível de contraste comparável à fluorescência. Em todo o caso, esse modo de observação pode ser sensível à poeira.
Testis in Paramount, não colorido, capturado com uma objetiva 20X. Campo claro (parte superior esquerda), fluorescência (parte superior direita), campo escuro (parte inferior esquerda), polarização (parte inferior direita). Dados da imagem cortesia de Robin Wacker, Günthersleben, Alemanha.
Isso não é tudo, os mais recentes escaneadores de lâmina virtual possuem outras ferramentas de formação de imagem que podem ajudá-lo a extrair dados melhores do seu experimento. Por exemplo, o nosso escaneador de lâmina VS200 pode focar-se através de múltiplas planos de tecido para:
- Capturar múltiplos planos na maior resolução
- Projetar amostras com até 100 µm de espessura
- Capturar imagens usando todos os métodos de observação disponíveis
- Obter facilmente informações a partir de todas as dimensões da sua amostra
- Calcular projeções (deconvolução, Z máximo ou imagem focal estendida)
O empilhamento Z pode capturar até 35 planos na maior resolução, facilitando a obtenção de informações de todas as dimensões da sua amostra.
Outra ferramenta útil é o mecanismo dispensador de óleo automático, que ajuda o sistema a alcançar a resolução mais alta.
A combinação destes diferentes modos de formação de imagem e recursos torna-se ainda mais poderosa quando usada com a especificidade molecular proporcionada pelas técnicas de marcação de anticorpo. No entanto, ainda pode ser difícil marcar eficaz e quantitativamente com fluorescência.
Tendo isso em mente, a nossa próxima sessão irá cobrir as tecnologias de formação de imagem que podem ajudar com aplicações de fluorescência multiplexada.
Essenciais tecnológicos para a multiplexagem de tecidos
A fluorescência multiplexada tornou-se uma ferramenta útil na pesquisa em imuno-oncologia devido ao incrivelmente complexo microambiente do tumor. Contudo, ela exige software, pessoal e equipamento especializados para criar um ensaio e aplicá-lo a um tumor de interesse.
Os fabricantes desenvolveram novas tecnologias que abordam as diferentes necessidades e problemas impediam que este tipo de ensaio fosse amplamente usado. Esses essenciais tecnológicos incluem:
Multiplexagem de alto nível que aborda:
| Compatibilidade do fluxo de trabalho oferece:
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Escaneamento da lâmina inteira que captura:
| Software que possa identificar fenótipos complexos:
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Uma visão geral do ensaio do marcador multiplexado UltiMapper™
Outra tecnologia útil para experimentos de formação de imagem multiplexada é o ensaio UltiMapper I/O.
Os ensaios UltiMapper I/O usam a tecnologia InSituPlex® para proporcionar uma multiplexação da lâmina inteira com alta resolução para fenotipagem de célula e perfil espacial de atividade do biomarcador. Como uma solução pré-otimizada com base no reagente, estes kits integram-se facilmente no equipamento e software existente por todo o fluxo de trabalho de imunoistoquímica (IHC) e permite que os pesquisadores passem da coloração para a aquisição de imagem e avaliação em somente um dia.
A imagem a seguir mostra o processo simples de 4 etapas:
Etapa 1: Recuperar:
- Retirar a cera e recuperar amostra normalmente
Etapa 2: Coloração
- Incubar a amostra com uma mistura de anticorpos com código de barras em uma única etapa de coloração
- Sequência de DNA única (código de barras) ligada a cada anticorpo
Etapa 3: Amplificar
- Amplificar todos os alvos simultaneamente
- Aumenta a proporção de códigos de barra por anticorpo, permitindo a ligação de mais filamentos da sonda complementar
Etapa 4: Detectar
- Adicionar sondas de DNA fluorescente complementares para ligar os alvos
- As amostras estão prontas para serem projetadas
- Tecnologia de hibridização de DNA
Três fatores que influenciam a qualidade da imagem para quantificação
Ao conceber o seu experimento, tenha em mente que a combinação certa de tecnologias ópticas e de coloração resultarão na melhor análise a jusante. Pode tentar analisar o quanto quiser as imagens de baixa qualidade de um conjunto de reagentes inadequado ou com uma aquisição e configuração óptica fraca, você não conseguirá obter uma boa análise.
Veja a seguir três fatores ópticos que influenciam a qualidade da imagem para quantificação:
- Cor de iluminação precisa: é importante ter uma representação de cor reprodutível e verdadeira na marcação por hematoxilina-eosina. A transmissão óptica deve ter características espectrais que mimetizam fontes de luz de halogênio para reproduzir o roxo, o ciano e o rosa.
O LED True Color do sistema VS200 para iluminação transmitida tem as mesmas características espectrais e a potência de uma lâmpada de halogênio, para que colorações roxas, cianogêneas e rosas sejam representadas e renderizadas corretamente.
- Fidelidade de cor e precisão: além das características espectrais de iluminação certas, a câmara do microscópio deve ter fidelidade e precisão de cor excelentes. Certifique-se de usar uma câmera com correção de cor com o equilíbrio correto para representar o tecido com precisão. A interpretação de imagens digitais a olho nu pode ser subjetiva, pois configurações de aquisição diferentes levam a resultados diferentes em termos de imagem, mas as câmeras com correção de cor e perfis ICC reproduzem imagens com intensidade e cor excelentes em monitores de computador.
A interpretação de imagens digitais a olho nu pode ser subjetiva, pois configurações de aquisição diferentes levam a resultados diferentes em termos de imagem. O escaneador VS200 usa câmeras com correção de cor e fornece perfis ICC para reprodução de imagens com intensidade e cor excelentes em monitores de computador.
- Nivelamento do campo: capturar uma série de imagens onde o campo não seja plano ou não exista correção integrada, pode causar um efeito de halo em todos os campos de visão, o que é um problema para a quantificação. Nesse caso, você deve usar um equilíbrio e filtragem não lineares de cada campo de visão, o que consome tempo e recursos. Considere a configuração óptica que ajudará a maximizar o nivelamento de campo para conseguir um melhor resultado Nivelamento.
Objetivas X Line™ de alto desempenho no escaneador de pesquisa VS200 ajuda a melhorar o nivelamento da imagem.
Considerações finais
Uma vez que as imagens podem ser adquiridas em volume com pilha Z de foco múltiplo, você pode melhorar e aprimorar o contraste das imagens usando métodos como deconvolução, projeções de intensidade máxima ou visualizações de foco estendido, o que o permite selecionar o melhor foco para a imagem.
Em última instância, a solução para a análise quantitativa é uma combinação de bons marcadores, bons componentes ópticos e software suficientemente poderoso para análise de segmentação, o que permitirá apurar informações estatísticas biologicamente relevantes.
Para aprender mais sobre a extração de dados avançados dos seus experimentos de formação de imagem e de fluorescência multiplexada multimodos, participe do meu webinar sob demanda aqui.
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