A citometria de fluxo é uma das principais técnicas usadas para identificar e segmentar populações celulares devido à sua capacidade de avaliar grandes populações de células com rapidez usando marcadores fluorescentes. No entanto, a citometria de fluxo tem algumas limitações que têm que ser compensadas com outras técnicas. Com o avanço das ferramentas de análise de imagem, a citometria de imagem surgiu como uma melhor maneira de acessar ainda mais informações durante a avaliação de grandes populações de células.

Esta postagem explorará detalhadamente a citometria de fluxo e mostrará como o crescente campo da citometria de imagem está fornecendo ferramentas poderosas aos pesquisadores para melhorar o seu trabalho.

O que é citometria de fluxo?

Há décadas, a citometria de fluxo tem sido uma das principais ferramentas para identificar e analisar marcadores moleculares em populações de células. Nesta técnica, as células são dissociadas em células individuais em suspensão e marcadas com anticorpos conjugados com fluorescência direcionados aos marcadores de interesse. Então, estas células passam por um citômetro de fluxo, onde podem ser analisadas individualmente quanto à expressão de cada marcador, levando a valiosos dados quantificáveis na população de células.

Esta ferramenta essencial permite que os pesquisadores quantifiquem a presença e a intensidade de proteínas nas células de seu interesse, possibilitando a segmentação e a identificação de populações de células, assim como a classificação das células.

Desvantagens da citometria de fluxo

Embora a citometria de fluxo possa fornecer grandes volumes de dados quantificáveis a nível celular, essa técnica tem desvantagens devido ao fato de que a medição tem que ser feita a partir de células individuais em suspensão.

As desvantagens da citometria de fluxo incluem:

• Muitas células são cultivadas enquanto se aderem às estruturas de scaffolds e placas de cultura de tecidos ou a tecidos ou estruturas com outras células. Quando as células são dissociadas de seu ambiente, sua expressão de proteína pode mudar. Além disso, os dados sobre as interações proteicas entre as células podem ser perdidos.
• Os dados sobre a morfologia celular, assim como a localização dos marcadores moleculares na célula, não podem ser acessados.
• A tensão causada nas células durante a citometria de fluxo pode afetar sua capacidade de continuar crescendo após a análise. Geralmente, um grande número de células não sobrevive ao processo.
• As ferramentas de medição usadas em um citômetro de fluxo limitam a visualização dos dados quantitativos em gráficos. A avaliação visual das células é impossível.

Devido a essas desvantagens, a análise por citometria de fluxo geralmente é complementada com a marcação imuno-histoquímica das células em seu ambiente. No entanto, a maioria das ferramentas de análise de imagem não consegue fornecer o mesmo nível de dados quantitativos e as características estruturais das células individuais não podem ser correlacionadas uma a uma com suas análises através da citometria de fluxo.

O crescente campo da citometria de imagem trata dessas questões usando ferramentas de formação de imagem que conseguem fornecer dados quantitativos sobre populações equivalentes aos da citometria de fluxo. Nosso software e estação de triagem de alto conteúdo scanR são exemplos de ferramentas que podem atender a essas necessidades.

Benefícios da citometria de imagem

Na citometria de imagem, a imagem das células é captada diretamente em seu ambiente de cultura e, em seguida, as imagens são processadas e traduzidas em análises quantitativas dos parâmetros de interesse.

Os benefícios da citometria de imagem incluem:

• Risco reduzido de alterações na expressão de proteína causadas pela dissociação.
• Os dados sobre a morfologia celular e a localização da proteína são mantidos e podem ser integrados em análises quantitativas. Por exemplo, é possível constatar a população de células que expressam altos níveis de um marcador dentro do núcleo.
• Nenhuma tensão física é imposta às células durante a análise. Além disso, a citometria de imagem pode tirar vantagem da tecnologia de inteligência artificial (IA) para identificar células e características celulares com o mínimo ou ausência total de coloração. Isso ajuda a garantir que as células possam continuar a ser cultivadas após a análise.
  

  (A) Imagem de campo claro de células sem marcação. (B) Localização da actina prevista por IA.

• As mesmas células podem ser monitoradas e rastreadas ao longo do tempo. Isso pode ser valioso para a descoberta de fármacos, diferenciação celular e muito mais. Por exemplo, se um pesquisador quisesse ver o efeito de um fármaco nas células primárias do paciente com o passar do tempo usando citometria de fluxo, teria que cultivar e tratar de réplicas adicionais de cada ponto de tempo, porque a dissociação é necessária. Como as células podem permanecer em um ambiente de cultura durante a citometria de imagem, a mesma réplica pode ser medida em vários pontos de tempo.

Para pesquisadores familiarizados com citometria de fluxo, é fácil transitar para a análise de dados com citometria de imagem no software scanR, pois ele usa histogramas e gráficos de dispersão semelhantes na exibição dos dados. Assim como na citometria de fluxo, as populações podem ser selecionadas por meio de portas nos gráficos, para a realização de análises em vários níveis. Ao contrário da citometria de fluxo, cada parâmetro avaliado pode ser correlacionado de volta com a imagem para ser confirmado visualmente, pois os dados são coletados diretamente das imagens.

Considere o seguinte exemplo. No software scanR, você pode clicar em qualquer ponto de dado para ver a célula em questão ou criar uma galeria de imagens de uma população fechada em uma porta. Isso acrescenta uma camada de certeza visual de que as populações de células estão segmentadas corretamente e de que você está identificando as populações de interesse corretas.

Citometria de imagem no software scanR. A) Os pontos identificados como células são fechados em portas e, em seguida, exibidos como um histograma (B). As células são então separadas em duas populações, que podem ser vistas nas galerias de imagens (C, D).

Resumindo, a citometria de imagem com o software scanR utiliza algumas das melhores ferramentas analíticas da citometria de fluxo e as combina com os benefícios da análise baseada em imagem. Veja a tabela abaixo para obter um resumo dessas vantagens:

O versátil conjunto de ferramentas da citometria de imagem permite que os pesquisadores quantifiquem e avaliem grandes populações de células com base em qualquer característica visível em uma imagem – morfologia, localização, intensidade e localização de fluorescência e muito mais – sem exigir uma manipulação que gere tensão nas células. Os pesquisadores podem reunir resultados mais amplos e mais profundos de seus experimentos, levando a uma pesquisa mais eficiente e com melhor qualidade.

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