Durante o meu tempo na Olympus, fiquei surpreso com a criatividade das configurações dos microscópios confocais dos nossos clientes, desde os suportes para amostra feitos por eles mesmos a aparelhos experimentais. Visto que o nosso microscópio confocal FV3000 possui as configurações vertical e invertida, podemos acomodar e orientar as amostras de diversas formas.
O microscópio FV3000 foi concebido para observações de fluorescência. Contudo, com um pouco de engenhosidade, ele também pode realizar formação de imagem confocal de reflectância em alguns casos. Apesar da sua versatilidade e praticidade, a técnica de formação de imagem confocal de reflectância é geralmente negligenciada, portanto, discutirei uma forma inteligente de usá-la para ajudá-lo a obter o máximo do seu sistema.
Irei destacar como a formação de imagem confocal de reflectância pode ser usada para extrair informações endógenas de tecidos biológicos.
Formação de imagem confocal de reflectância de complexos biomoleculares fibrilares
Um dos usos de um caminho óptico de reflectância é a captura de sinais endógenos para adicionar contraste e proporcionar consciência sobre o ambiente da amostra.
Funciona assim: a interface entre as estruturas proteicas fibrilares biológicas e a água produz um sinal de contraste refletivo forte. Ao não efetuar o rastreamento da luz de excitação para um detector TruSpectral definido para uma largura de banda sobreposta, é possível identificar estruturas celulares específicas, o estado de organização do ambiente da matriz extracelular ou características da superfície do material.
Convenientemente, o microscópio confocal FV3000 apresenta um caminho óptico completamente baseado em espectro, de forma que todos os canais podem ser usados para detecção de reflectância. Quando combinada com as suas observações de fluorescência, esta capacidade de reflectância multiespectral adicionada pode extrair a localização de estruturas celulares não identificadas.
Considere este exemplo: gerei imagens de uma lâmina de seção de cérebro de rato fixo identificada com imunofluorescência, fornecida pela EnCor Biotechnology, Inc. Como pode ser visto nas imagens a seguir (Figura 1), uma aquisição VBF de três canais padrão revela uma excelente identificação específica para epítopos de dendritos neuronais (laranja), neurônios catecolaminérgicos (magenta) que contêm dopamina ou norepinefrina e intercalação de corantes que fornecem a nossa marcação nuclear (azul-claro).
Figura 1: seção do cérebro de rato identificada com imunofluorescência de três cores colorida com anticorpos da EnCor Biotechnology, Inc. Painéis superiores: imagem de campo inteiro do plano Z único adquirida com uma objetiva X Line de 20X. Painéis inferiores: resolução real de píxeis de um quadrado de inserção destacado.
Apesar do fundo de fluorescência forte e de amplo espectro criado pela preparação de imunofluorescência, podemos usar as nossas habilidades em reflectância para extrair mais informações endógenas.
Usando quatro canais simultaneamente para adquirir a imagem da reflectância das linhas de laser 405, 488, 561 e 640 nm, podemos criar um mapa multiespectral dos neurônios mielinados dentro deste tecido. É possível encontrar um exemplo nas imagens a seguir (Figuras 2 e 3).
 Figura 2 (esquerda): mescla dos três canais do sinal derivado da imunofluorescência mostrado na Figura 1. Direita: imagem do mesmo campo de visão de quatro canais mesclados da formação de imagem confocal de reflectância adquirida em simultâneo usando linhas de laser 405, 488, 561 e 640 nm. |  Figura 3 (topo): imagens confocais de reflectância individuais de cada linha adquirida em simultâneo. Inferior: imagens mescladas de neurônios contendo dopamina e identificados com imunofluorescência, e a imagem confocal de reflectância multiespectral da mielinização de axônios endógenos. |
Você pode usar esta informação não marcada para julgar o grau de mielinização ocorrendo nos neurônios de interesse que foram seletivamente identificados por imunofluorescência ou para ajudar com as aplicações que exigem o rastreamento de axônios.
A formação de imagem confocal de reflectância pode ser usada também para esclarecer a matriz extracelular de modelos de cultura de tecido 3D. Como pode ser observado nas imagens a seguir (Figura 4), os neovasos crescendo durante a angiogênese interagem de perto com as fibrilas de colágeno do ambiente estromal.
Figura 4: projeção Z de um vaso sanguíneo impresso em 3D dentro de uma matriz de colágeno. Superior: a imagem confocal de fluorescência das células endoteliais identificadas com rodamina. Centro: imagem confocal de reflectância de 405 nm mostrando a rede fibrilar de colágenos e as áreas de remodelação proximais ao vaso. Inferior: a imagem mesclada. A escala gráfica é igual a 100 µm.
Ao usar os microvasos isolados Angiomics™ da Advanced Solutions Life Sciences para recapitular a angiogênese nativa in vitro com o microscópio confocal FV3000, fica claro que os neovasos angiogênicos (visualizados através da fluorescência confocal) reorganizam as fibrilas de colágeno imediatamente adjacentes (visualizadas usando a formação de imagem de reflectância) à medida que crescem no ambiente estromal 3D.
