Todos os anos, a Nature Methods analisa as tecnologias e abordagens que impulsionaram o setor de ciências da vida no ano passado e, em seguida, seleciona as mais populares e influentes. Em 2017, a Nature Methods nomeou organoides como Método do Ano. Desde então, a pesquisa sobre organoides tem sido frutífera graças aos esforços incansáveis de muitos pesquisadores.
De maneira simples, organoides são culturas de tecidos tridimensionais (3D) que podem ser derivadas de tecidos ou células-tronco. Organoides são usados para uma ampla gama de pesquisas, uma vez que são essencialmente versões simplificadas e miniaturizadas de tecidos ou órgãos humanos. Eles simulam de perto a estrutura fisiológica e a função dos tecidos in situ e podem manter a informação genética de forma estável através de muitas passagens.
Devido à sua capacidade de imitar partes do corpo humano, os pesquisadores podem usar organoides para:
- Obter informações sobre o processo de desenvolvimento dos órgãos
- Testar a função dos medicamentos
- Desenvolver terapias regenerativas
Este post vai explorar algumas das pesquisas sobre organoides mais recentes e compartilhar como os sistemas de formação de imagem microscópica estão avançando neste importante trabalho.
Avanços na pesquisa sobre organoide
Os pesquisadores continuam a produzir novas pesquisas usando organoides. Aqui temos alguns estudos notáveis:
1. Modelo de organoide de glioblastoma derivado do paciente e biobanco recapitula heterogeneidade inter e intratumoral
Em 2019, pesquisadores da Universidade da Pensilvânia publicaram um artigo intitulado "A Patient-Derived Glioblastoma Organoid Model and Biobank Recapitulates Inter- and Intra-tumoral Heterogeneity" (Um modelo e um biobanco de organoide de glioblastoma derivado do paciente recapitulam a heterogeneidade inter e intratumoral) no Cell. Ele relatou o estabelecimento de um modelo e biobanco de glioblastoma organoide (GBO) derivado do paciente.
O estudo mostrou que o GBO mantém as principais características do glioblastoma e pode ser imediatamente usado para desenvolver estratégias de tratamento para pacientes. O biobanco estabelecido pelos pesquisadores fornece recursos valiosos para estudos básicos e translacionais do glioblastoma.
Os pesquisadores documentaram o processo de crescimento e as mudanças morfológicas do organoide observadas sob um microscópio. Eles também observaram os padrões de expressão de alguns marcadores proteicos no organoide usando microscopia confocal de escaneamento a laser.
Este trabalho demonstrou a aparente heterogeneidade na morfologia e características das células organoides, bem como sua composição celular altamente semelhante ao tumor parental.
2. Dinâmica de acessibilidade da cromatina em um modelo de desenvolvimento do prosencéfalo humano
Em 2020, o artigo intitulado "Chromatin accessibility dynamics in a model of human forebrain development" (Dinâmica de acessibilidade da cromatina em um modelo de desenvolvimento do prosencéfalo humano) foi publicado na Science. Nele, os pesquisadores descreveram o processo de cultura para criar e o uso pretendido do organoide do prosencéfalo humano. -montar em diferentes partes do prosencéfalo. Eles demonstraram como os organoides do prosencéfalo humano podem se automontar em diferentes partes do prosencéfalo.
O mais interessante é que os pesquisadores também encontraram uma maneira de estender a vida útil dos organoides do prosencéfalo humano em até 300 dias. Isso é tempo suficiente para observar o desenvolvimento dos organoides do prosencéfalo em estruturas mais complexas.
3. Amplificação de progenitores de interneurônios humanos promove tumores cerebrais e defeitos neurológicos
Em 2022, o artigo "Amplification of human interneuron progenitors promotes brain tumors and neurological defects" (Amplificação de progenitores de interneurônios humanos promove tumores cerebrais e defeitos neurológicos) foi publicado na Science. Este estudo revelou os processos específicos de desenvolvimento humano responsáveis pelas malformações do desenvolvimento cortical (MCDs), que podem levar a atrasos no desenvolvimento e epilepsia em crianças.
Os pesquisadores estabeleceram um modelo de organoide do cérebro humano para o complexo de esclerose tuberosa (TSC) e identificaram um tipo específico de células-tronco neurais: o progenitor interneurônio tardio caudal (CLIP). Nas TSCs, as células de CLIP proliferam excessivamente, produzindo excesso de interneurônios, tumores cerebrais e malformações corticais.
Organoides são modelos promissores para estudar desenvolvimento, doenças e medicamentos. Eles também têm amplas perspectivas em outros campos, como o da medicina regenerativa. No entanto, ainda há muitos desafios na cultura, observação e análise de dados quantitativos de organoides, já que suas condições e estruturas de cultura são mais complexas do que as das células ligadas.
Três maneiras pelas quais a formação de imagem microscópica avança na pesquisa de organoides
Felizmente, o equipamento de formação de imagem microscópica pode ajudar a superar esses desafios. Aqui apresentamos três maneiras pelas quais os sistemas e o software de formação de imagem microscópica estão avançando na pesquisa de organoides:
1. Controle de qualidade na cultura de organoides
O método típico de preparação de organoides é isolar células embrionárias ou células-tronco pluripotentes induzidas e, em seguida, cultivar essas células em meios de suporte (como Matrigel) para permitir seu crescimento tridimensional.
Citocinas, fatores de crescimento e moléculas pequenas são adicionados ao meio para ativar ou inibir vias de sinalização específicas envolvidas na formação de organoides. As vias de sinalização são as mesmas que medeiam o desenvolvimento e a manutenção da homeostase dos órgãos equivalentes in vivo.
De acordo com a pesquisa do Dr. Takanori Takebe, do Instituto de Pesquisa da Universidade Médica e Odontológica de Tóquio, a eficiência da diferenciação subsequente em organoides é muito afetada pelas diferenças no estágio inicial de proliferação durante a cultura de manutenção. Ele descobriu que nas linhas celulares iPS capazes de diferenciação, as colônias formadas a partir da maioria das células individuais aderiram após a passagem no estágio inicial de proliferação.
O Dr. Takebe levantou a hipótese de que a maior frequência de morte celular nos estágios iniciais da cultura de manutenção em linhagens de células iPS resistentes à diferenciação causa um número menor de colônias de células iPS, o que, em última análise, diminui sua eficiência de diferenciação em organoides de brotos hepáticos. Como resultado, a formação reproduzível de organoides exige tanto o desenvolvimento de protocolos mais ideais para a diferenciação de organoides quanto a otimização da cultura para as células iPS indiferenciadas originais. Para obter novas informações e melhorar os protocolos experimentais, o Dr. Takebe usa nosso sistema de monitoramento de incubação.
Usando o sistema CM30 para aquisição e análise de dados de lapso de tempo de amostras cultivadas, os pesquisadores podem entender o status das células iPS durante a cultura de células e identificar os principais fatores para aumentar a eficiência da diferenciação para melhorar ainda mais os protocolos experimentais.
Devido ao longo tempo de cultura dos organoides e ao alto custo dos meios e aditivos necessários para manter seu crescimento, os pesquisadores devem prestar atenção especial ao processo de cultura dos organoides e ao seu crescimento, além de evitar a contaminação.
Graças ao monitoramento remoto do sistema CM30, não há necessidade de entrar na sala limpa para remover as amostras da incubadora para exame microscópico. Isso aumenta muito a eficiência experimental e reduz o risco de contaminação.
Desenvolvimento de organoides em uma incubadora. Imagens capturadas usando o sistema de monitoramento de incubação CM. Dados da imagem cortesia de ACEL, Inc.
2. Formação de imagem microscópica de organoides
Como os organoides são culturas de células em 3D com um determinado volume, é preferível usar dispositivos de formação de imagem microscópica que possam adquirir informações de imagem do eixo Z de várias camadas para formação de imagem 3D. Esse recurso permite que você obtenha informações completas sobre as características morfológicas e as estruturas celulares internas dos organoides na formação de imagem.
Microscopia confocal de escaneamento a laser para formação de imagem de organoides
Os microscópios confocais de escaneamento a laser são adequados para a aquisição de imagens volumétricas em 3D de um organoide. Graças ao pinhole na frente do detector que bloqueia o fundo fora de foco, somente as informações na profundidade de interesse são capturadas com alta resolução axial.
Nosso microscópio confocal de escaneamento a laser FLUOVIEW™ FV4000 apresenta formação de imagem de precisão com nosso detector SilVIR™, que permite uma alta relação sinal-ruído, formação de imagem mais precisa e alta resolução espacial e espectral. O detector SilVIR usa nossa tecnologia patenteada* para permitir a contagem de fótons de alta variação dinâmica para obter dados precisos de formação de imagem 3D. A tecnologia também possibilita a reconstrução de imagens 3D precisas, o que é ideal para a investigação de estruturas de organoides.
*Número da patente US11237047.
O sistema FV4000 também oferece uma solução comprovada de infravermelho próximo (NIR). A formação de imagem de NIR fornece penetração profunda, baixa fototoxicidade e baixa interferência de autofluorescência tecidual. Como resultado, ele funciona com vários contrastes fluorescentes na faixa visível para formação de imagem de fluorescência multicolorida sem diafonia de organoides com potencial para monitoramento de longo prazo de atividades organoides.
Observação contínua de esferas de células cultivadas em 3D por 21 dias usando o microscópio confocal de escaneamento a laser FLUOVIEW. O núcleo é rotulado com SYTOX Orange (vermelho). O citoesqueleto é rotulado com Alexa Fluor 488 (verde).
Microscopia multifotônica para formação de imagem de organoides
Para obter uma imagem completa de um organoide com um volume grande, há uma demanda mais rigorosa de profundidade de formação de imagem. Os microscópios multifotônicos são sistemas de formação de imagem microscópica adequados para formação de imagem profunda de organoides.
Aqui apresentamos uma visão geral de como esses sistemas podem ajudar na formação de imagem profunda de organoides:
Nosso microscópio multifotônico FV4000MPE tem um design óptico avançado para otimizar a sensibilidade e a resolução em formação de imagem profunda. Uma faixa do comprimento de onda de 400–1600 nm suporta excitação IV mais eficiente sem comprometer a detecção de comprimento de onda visível.
Sua trajetória ótica de detecção com uma grande abertura clara e alta eficiência suporta o agrupamento de mais sinais de emissão, principalmente fótons dispersos em grandes ângulos de incidência. Além disso, o detector SilVIR no núcleo do sistema oferece ruído excepcionalmente baixo e alta sensibilidade com uma alta relação sinal-ruído na faixa de comprimento de onda do visível ao infravermelho próximo.
Esses recursos ópticos permitem capturar informações mais profundamente dentro de um organoide. As objetivas TruResolution™ melhoram o brilho e a resolução de formação de imagem profunda com compensação automática de aberração esférica. Essas ópticas de alto desempenho permitem que informações mais detalhadas em uma imagem 3D sejam capturadas em todos os níveis.
Microscopia de super-resolução para formação de imagem de organoides
Existem demandas ainda maiores no sistema de formação de imagem para organoides com um volume grande. O sistema de formação de imagem deve adquirir imagens de pilha Z e unir as imagens adquiridas, o que exige uma aquisição de imagens em alta velocidade. É aqui que entra a microscopia confocal de disco giratório.
Enquanto os microscópios de escaneamento a laser usam um único pinhole, os microscópios confocais de disco giratório usam um disco opaco com centenas de pinholes que giram em altas velocidades. A imagem da amostra inteira é formada de uma só vez em vez de ponto por ponto, aumentando significativamente a velocidade da formação de imagem e reduzindo o fotodano.
Nosso microscópio de super-resolução IXplore™ SpinSR é um sistema confocal de disco giratório que apresenta rápida formação de imagem, alta sensibilidade, baixa fototoxicidade e módulos de super-resolução escaláveis com resoluções tão finas quanto 120 nm. Esses recursos suportam rápida formação de imagem de pilha Z e união de imagens de organoides.
Sistema de microscópio de super-resolução IXplore SpinSR.
O sistema IXplore SpinSR também funciona com nossa série de objetivas de óleo de silicone. Essas ópticas permitem imagens nítidas de super-resolução com menos desfoque, mesmo em formação de imagem profunda de organoides.
Nossas objetivas de óleo de silicone usam um óleo de silicone especial com um índice de refração de 1,40 como meio de imersão. Isso satisfaz os requisitos para aquisição de imagens de alta resolução (superiores às objetivas de imersão em água) e observação de amostras altamente dispersos, como organoides e outras amostras espessas.
3. Análise quantitativa de imagens de organoides
Até agora, discutimos como você pode adquirir imagens macro e micro nítidas de organoides usando equipamentos de formação de imagem microscópica de última geração, como microscópios confocais de escaneamento a laser, multifotônicos e de super-resolução. Essas imagens permitem aos pesquisadores observar a estrutura fina de cada célula ou até mesmo o nível subcelular dentro de uma amostra 3D.
Para a pesquisa em ciências da vida, não é suficiente observar apenas os detalhes de uma amostra. Em experimentos que usam modelos de organoides para validação da eficácia e análise toxicológica de medicamentos, também são necessárias análises qualitativas e quantitativas da morfologia do organoide e de suas células internas. Por exemplo, comparar as diferenças entre vários organoides em diferentes concentrações de dosagem de medicamentos em uma placa multipoços pode levar a dados estatísticos mais convincentes.
Para atender a essas necessidades de aplicação, desenvolvemos o software de análise de células NoviSight™ para identificação complexa de células 3D e análise de amostras, como esferoides celulares ou organoides cultivados em placas multipoços.
Interface do usuário do software NoviSight. Este exemplo mostra uma análise quantitativa de células mitóticas dentro de esferoides celulares tratados com diferentes concentrações de paclitaxel.
Aqui apresentamos alguns de seus recursos úteis para pesquisa de organoide:
- A tecnologia exclusiva de análise de células True 3D pode ajudar a reproduzir de forma realista a morfologia espacial de suas amostras
- O módulo de medição multiparamétrica pode ajudá-lo a identificar rapidamente os componentes de organoides e celulares e obter dados úteis, como volume, área de superfície, distância espacial e intensidade de fluorescência
- A interface do usuário interativa permite combinar facilmente imagens de células com suas estatísticas para uma análise estatística precisa dos dados
Como os organoides podem ser usados para simular de perto os tecidos humanos correspondentes, tanto em nível genético quanto morfológico, eles têm amplas perspectivas de aplicação na simulação do processo de desenvolvimento, pesquisa de doenças, imunidade clínica, sensibilidade de tumores a medicamentos, medicina regenerativa e medicina de precisão.
Apesar disso, é importante lembrar que os organoides ainda são uma tecnologia emergente. Existem limitações na cultura, controle de qualidade e reprodutibilidade experimental de organoides. Ainda há um longo caminho a percorrer em pesquisa básica, aplicação e tradução de organoides.
Com uma rica história em óptica e microscopia, a Evident está empenhada em apoiar pesquisadores de organoides em todo o seu processo experimental. Ao fornecer soluções completas para pesquisa de organoide, desde a preparação de amostras até a aquisição e análise de dados 3D, contribuímos para a nossa missão de tornar o mundo um lugar mais saudável e seguro.
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