Visualização de proteínas de reparo de DNA com o microscópio confocal FV3000
Aquisição de imagens de células vivas de células U2OS após danos no DNA induzidos por laser
As quebras de DNA de dupla hélice constituem uma das formas mais prejudiciais de danos no DNA. Como resposta ao dano, são acionadas vias de resposta a danos no DNA (DDR) nas células, levando ao recrutamento de fatores de DDR para o local de quebra, bem como à sinalização do ponto de verificação do ciclo celular e à regulação de atividades de reparo de DNA. A sinalização e a reparação imediatas e fiáveis do local de quebra são cruciais para a viabilidade da célula e para evitar mutações, as quais podem levar ao desenvolvimento de câncer. Assim, a compreensão dos mecanismos envolvidos no reparo de DNA é de vital importância. Nesta aplicação, foram utilizadas células epiteliais cancerígenas de osteossarcoma humano (U2OS) para estudar o recrutamento de proteínas de reparo de DNA em danos induzidos por laser, incluindo locais de quebra de DNA de dupla hélice, usando o microscópio confocal FV3000. As imagens resultantes permitiram (1) determinar a cinética e níveis de acúmulo de proteínas de reparo recrutadas para locais de quebra e (2) caracterizar a colocalização de reguladores transcricionais endógenos e fatores de via de DDR em locais de quebra de DNA.
Figura 1: Representação esquemática do protocolo do experimento
O MRE11 cDNA é clonado em um vetor de expressão de GFP-alvo que, em seguida, é transferido para células U2OS. Após a sensibilização usando bromodeoxiuridina (BrdU) ou Hoechst, os danos no DNA são induzidos por uma varredura de linha da região de interesse (ROI) no núcleo usando o laser de 405 nm do microscópio FV3000. Em seguida, a aquisição de imagens de células vivas usando o laser de 488 nm é realizada para monitorar a cinética de recrutamento de MRE11 como resposta aos danos induzidos por laser.
Condições de aquisição de imagens
Objetiva: objetiva de imersão em óleo de 60x super corrigida (PLAPON60XOSC)
Microscópio: microscópio confocal de varredura a laser FLUOVIEW FV3000
Lasers: 405 nm (estimulação da ROI), 488 nm (GFP, verde)
Aquisição de imagens de células vivas cuidada para medições quantitativas
A exposição repetida à luz de excitação do laser ao longo de uma imagem com lapso de tempo pode resultar em fotobranqueamento e fototoxicidade, impactando a capacidade de obtenção de medições de dados quantitativos a partir do experimento. No protocolo, é necessário equilibrar uma estimulação a laser potente e uma aquisição de imagens de células vivas cuidada para capturar dinâmicas de proteínas de reparo quantificáveis imediatamente após os danos no DNA induzidos por laser. Para isso, foi usado o microscópio confocal FV3000, que incorpora a tecnologia de detecção TruSpectral da Olympus e os detectores GaAsP de alta sensibilidade, minimizando a potência do laser necessária para uma aquisição de imagens contínua das células vivas. Além disso, o TruFocus foi utilizado para manter o foco ao longo do experimento de aquisição de imagens. Combinadas, essas tecnologias permitiram a obtenção de dados com lapso de tempo exatos, os quais foi possível quantificar em relação ao acúmulo de MRE11 dependente de danos do fator de DDR em locais de quebra do DNA.
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Figura 2: Acúmulo de MRE11 dependente de danos no local de quebra do DNA
As células U2OS expressando GFP-MRE11 foram sujeitas a danos no DNA induzidos por um laser de 405 nm, seguido de uma aquisição de imagens com lapso de tempo de GFP por meio de um laser de 488 nm. A aquisição de imagens das células decorreu durante 6 minutos, em intervalos de 20 segundos, para visualizar e quantificar a localização do MRE11 antes e após os danos no DNA.
Objetiva super corrigida para análise exata da colocalização
Além do estudo da cinética do recrutamento de MRE11 para locais de quebra de hélice, também foram examinadas as respostas da γH2AX, uma proteína histona que é fosforilada em quebras de DNA de dupla hélice e que ativa vias de DDR, e da CHD4, uma proteína que desempenha um papel importante na regulação transcricional epigenética. Para realização de estudos de colocalização exatos, é importante minimizar a aberração cromática, que pode originar um desvio lateral significativo de canais de aquisição diferentes. Para minimizar os efeitos da aberração cromática nos estudos de colocalização, foi utilizada a objetiva super corrigida para aberração cromática PLAPON60XOSC2 da Olympus, a fim de obter imagens de colocalização confiáveis com aberração cromática lateral e axial extremamente baixas. Isso permitiu determinar que a CHD4 e a γH2AX se colocalizam em locais de danos no DNA no núcleo.
Figura 3: Recrutamento de proteínas endógenas para reparo de danos no DNA para quebras de hélice de DNA
Detecção de células epiteliais cancerígenas de osteossarcoma humano U2OS de CHD4 (verde, Alexa Fluor 488) e γH2AX (vermelho, Alexa Fluor 594) endógenas após danos no DNA induzidos por laser. A imagem mesclada exibe a colocalização de CDH4 e γH2AX.
Como o microscópio confocal FV3000 facilitou nosso experimento
O sistema totalmente espectral com detectores GaAsP de alta eficiência proporciona alta sensibilidade para aquisição de imagens de células vivas
A série do microscópio FV3000 usa a tecnologia de detecção TruSpectral da Olympus que difrata a luz por transmissão, por meio de uma unidade de holograma de fase volumétrica. Essa tecnologia permite um rendimento de luz muito superior, quando comparada a unidades de detecção espectral convencionais com grades de tipo refletivo. O detector espectral de alta sensibilidade (HSD) de dois canais do microscópio FV3000 usa tecnologia TruSpectral com PMTs GaAsP e resfriamento Peltier para obter uma alta eficiência quântica de 45% com uma alta relação sinal-ruído. Essa combinação de tecnologias de detecção permite uma detecção potente de alta sensibilidade e minimiza a potência do laser necessária para observação de tecido vivo.
Objetiva super corrigida PLAPON60XOSC2 para análise de colocalização confiável com aberração cromática baixa
Essa objetiva de imersão em óleo reduz a aberração cromática lateral e axial em um espectro de 405–650 nm. As imagens de colocalização são adquiridas de forma confiável e as imagens são medidas com exatidão posicional superior. A objetiva também compensa a aberração cromática por meio da luz infravermelha próxima, até 850 nm, tornando-a vantajosa para aquisição de imagens quantitativa.
Objetiva de aberração cromática baixa
Ampliação: 60x
AN: 1,4 (imersão em óleo)
DT: 0,12 mm
Intervalo de correção de aberração cromática: 405–650 nm
Manutenção do foco com o sistema TruFocus da Olympus
O modelo TruFocus usa luz infravermelha com fototoxicidade mínima (laser de classe 1) para identificar a localização do plano da amostra. O modo de foco automático (AF) de um disparo permite a configuração de várias posições de foco para amostras mais profundas, aumentando a eficiência da aquisição de empilhamento Z em experimentos de multiposição.
Comentário do Dr. Kyle Miller
Dr. Kyle Miller |
Dr. JaeJin Kim | A aquisição de imagens de fluorescência é uma técnica amplamente usada em estudos de sinalização e reparo de danos no DNA para analisar a localização e cinética dos fatores de resposta a danos no DNA em locais de danos no DNA. A obtenção dessa informação foi essencial para identificar como esses fatores detectam e reparam lesões no DNA em uma resolução de célula única. O microscópio FV3000 permitiu que o Dr. JaeJin Kim e outros no laboratório do Dr. Miller gerassem danos no DNA usando microirraidação a laser e estudassem o comportamento do fator de resposta a danos no DNA tanto em células fixas como em células vivas. A disponibilidade de detectores sensíveis, de capacidades de foco automático e de objetivas super corrigidas tornou o microscópio FV3000 em um instrumento eficaz na realização de estudos sobre as vias de resposta a danos no DNA em células cancerígenas humanas. |
Agradecimentos
Esta nota de aplicação foi preparada com a ajuda dos seguintes pesquisadores:
Universidade do Texas em Austin, NMS, Dr. Kyle Miller e Dr. JaeJin Kim
Produtos usados nesta aplicação
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