Microscopia polarizada e o que isso pode nos ensinar sobre os materiais que compõem nosso tecido esquelético

Introdução

A microscopia polarizada é uma técnica óptica avançada que melhora o contraste em espécimes birrefringentes. Ela oferece insights distintos sobre a estrutura e a composição de uma ampla variedade de materiais orgânicos e inorgânicos.

Dois tipos de microscopia polarizada são comumente usados: polarização linear e polarização circular. Como o nome implica, a microscopia polarizada linear usa a luz linearmente polarizada para iluminar o espécime. Em contraste, a microscopia polarizada circular emprega luz polarizada circular, tornando-a especialmente sensível à quiralidade (orientação à esquerda e direita) de estruturas dentro do espécime. Essas técnicas são usadas em campos como a biologia, ciência dos materiais e geologia para examinar a estrutura microscópica e propriedade de vários materiais.

Esta nota de aplicação explora essas técnicas de luz polarizada em detalhes, destacando como a microscopia polarizada circular permite melhor visualização de materiais birrefringentes em tecido esquelético.

Os materiais birrefringentes do tecido esquelético

A birrefringência é a propriedade de um material em que um único raio de luz incidente se divide em dois raios distintos quando passa pelo material. A pele, a córnea, os tendões, os ligamentos, o tecido muscular, a cartilagem e o osso são tecidos e órgãos que exibem birrefringência devido às suas estruturas anisotrópicas organizadas (as propriedades ópticas não são uniformes em todas as direções). Essa birrefringência afeta como os materiais no nosso tecido esquelético, como ossos e cartilagem, interagem com a luz polarizada.

Ossos em mamíferos e aves são materiais rígidos, feitos principalmente de colágeno e fosfato de cálcio. Os quatro tipos celulares encontrados em ossos são:

1. Osteoblastos, que criam novos ossos.
2. Osteócitos, que estão incorporados à matriz óssea.
3. Osteoclastos, que reabsorvem o osso.
4. Células osteoprogenitoras, que dão origem a osteoblastos.

A cartilagem trabalha em conjunto com o osso para formar o que é conhecido como tecido esquelético. Esse tecido conjuntivo especializado é flexível, mas resistente. Os três tipos diferentes de cartilagem são:

1. Cartilagem hialina: o tipo mais comum encontrado no corpo, incluindo o nariz, costelas, traqueia, laringe, brônquios e superfícies articuladas dos ossos. Ela desempenha uma função importante durante o desenvolvimento embrionário ao formar o esqueleto do feto e a placa de crescimento, que mais tarde é substituída pelo osso.
2. Fibrocartilagem: encontrada entre as vértebras da coluna e em algumas articulações.
3. Cartilagem elástica: encontrada na epiglote, cordas vocais e ouvido externo.

São conhecidas muitas substâncias que afetam a saúde do osso e da cartilagem. Uma é a vitamina C, também conhecida como ácido ascórbico. Estudos científicos mostraram que a vitamina C é essencial para a saúde do osso porque é necessária para a formação de colágeno e pode induzir a expressão dos genes da matriz óssea em osteoblastos. Na cartilagem, a vitamina C está associada a osteoartrite lenta (uma doença que causa degeneração articular) porque estimula a síntese de colágeno.

Entendendo a microscopia polarizada circular e linear

Para capturar imagens de alta qualidade dos ossos, cartilagem, vitamina C e outros materiais birrefringentes com a microscopia polarizada, é importante primeiro entender os métodos de iluminação polarizada linear e circular.

As fontes de luz geram luz não polarizada, que vibra em todos os ângulos em 360°. Quando a luz não polarizada passa por um polarizador, ela é convertida em luz polarizada linear. A luz linearmente polarizada passa através da amostra. Se a amostra é isotrópica (propriedades ópticas uniformes em todas as direções), ela não afeta a luz polarizada e a luz continuará no mesmo estado de polarização. No entanto, uma amostra anisotrópica mudará a polarização da luz conforme ela passa. Essa mudança na polarização permite que a luz passe por um analisador, que tem orientação perpendicular ao polarizador.

Uma desvantagem da polarização linear é a formação de isogiros, bandas escuras em padrão de cruz de Malta (cruzes com braços em forma de V), que aparecem no campo de visão. Isso ocorre quando a amostra formada tem simetria radial, o que faz com que a luz polarizada se divida em torno do centro radial e crie luz que não pode passar através do analisador. A cruz de Malta causa uma redução de intensidade, que afeta o uso das imagens para quantificação ou análise.

A polarização circular não tem essa desvantagem. Ela também usa um polarizador para converter luz comum em luz que vibra em um plano único (luz linearmente polarizada). No entanto, na polarização circular, um material birrefringente, como uma placa de quarto de onda, é colocado em um ângulo de 45° relativo ao polarizador no caminho da luz polarizada. A luz passará por um deslocamento de fase, que é a diferença no tempo que leva para que as ondas de luz passem pelo material. O resultado disso é uma luz com campo de rotação circular. Quando a luz em rotação circular passar pelo espécime, ele é refratado em todas as posições rotacionais de 360°. Ao colocar uma segunda placa de quarto de onda em um ângulo de 90° em relação à primeira placa na trajetória da luz refratada, esse efeito será cancelado. Isso recria a luz polarizada, que então pode passar através do eixo de transmissão do analisador. É importante dizer que ambas as placas de quarto de onda são giradas em 45° com relação ao polarizador, mas em direções opostas.

Figura 1. Imagens de cristais de vitamina C formadas com microscopia polarizada a) linear e b) circular usando o escâner de lâminas de pesquisa SLIDEVIEW™ VS200 da Evident com a objetiva MPLFLN40X (NA 0,75). (a) Com polarização linear, podemos ver os isogiros característicos (bandas pretas). (b) com a polarização circular na mesma amostra, não podemos ver qualquer artefato.
 

Formação de imagem de osso, cartilagem e vitamina C usando microscopia polarizada

Vitamina C, também conhecida como ácido ascórbico, é uma molécula quiral. Quando a luz polarizada passa pelos cristais de vitamina C, a quiralidade da molécula causa a rotação do plano de polarização da luz. A interferência da luz produz uma variedade de cores, criando belas imagens.

Figura 2. Imagens da vitamina C sob microscopia polarizada. a) Com polarização linear, podemos ver os isogiros característicos (cruzes de Malta). b) A polarização circular não produz cruzes de Malta. As estruturas que se parecem com pedras marrons aqui mostradas são cristais muito espessos. Imagens capturadas com o escâner de lâminas de pesquisa VS200 com a objetiva MPLAPON50X (AN 0,95).

Figura 3. Imagens de tecido conectivo e osso, onde as fibras de colágeno de diversas orientações são visualizadas na luz polarizada. a) Tecido conectivo visualizado usando luz polarizada linear. b) Tecido conectivo visualizado usando luz polarizada circular. c) Seção de osso transversal visualizada usando luz polarizada. d) Seção de osso transversal visualizada usando luz polarizada circular. As fibras de colágeno alinhadas transversalmente aparecem brilhantes, enquanto as alinhadas longitudinalmente aparecem escuras. Fibras com orientações intermediárias mostram tons de cinza diferentes. Imagens capturadas com o escâner de lâminas de pesquisa VS200 com a objetiva MPLAPON50X (AN 0,95).

A importância de usar formação de imagem polarizada para estudos do tecido esquelético e vitamina C

Capturar belas imagens usando microscopia polarizada é esteticamente agradável, mas qual é a relevância científica das imagens? No caso da vitamina C, a interação das moléculas com a luz polarizada é uma propriedade usada em análise química para determinar a concentração e a pureza da vitamina C. Isso normalmente é feito usando um polarímetro.

No osso, os estudos que usam a microscopia polarizada circular têm sido usados para mapear os padrões de orientação das fibras de colágeno. Isso está correlacionado aos dados de tensão do osso. Agora, sabemos que as fibras de colágeno em uma orientação predominantemente transversal têm melhor resistência a forças compressivas, enquanto as fibras longitudinais têm melhor resistência a forças de tração. Além disso, as fibras de colágeno com orientação de 45° em relação à lamela oferecem melhor resistência a cisalhamento.

Também foi demonstrado que a orientação das fibras de colágeno na cartilagem é importante para a resistência à pressão e deformação devido à carga ou ao movimento. Perturbações na organização de colágeno na cartilagem, mesmo pequenas, foram conectadas a doenças patológicas, como osteoartrite.

*Os componentes de polarização circular do escâner VS200 estão disponíveis apenas na EMEA. Entre em contato com o seu representante local de vendas da Evident para obter detalhes sobre a disponibilidade.
 

Referências

1. Bromage, T., et al. 2023. "Circularly Polarized Light Standards for Investigations of Collagen Fiber Orientation in Bone." The Anatomical Record. 274(1): 157–168. 
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3. Aghajanian. P., et al. 2025. "The Roles and Mechanisms of Actions of Vitamin C in Bone: New Developments." Journal of Bone and Mineral Research. 30(11): 1945–1955.
4. Khebtsov, N., et al. 2016. "Chapter 1: Introduction to Light Scattering by Biological Objects." Handbook of Optical Biomedical Diagnostics. 2nd ed., vol. 1: Light-Tissue Interaction, edited by V. V. Tuchin. 
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6. Clark. A., et al. 2002. "The Effects of Ascorbic Acid on Cartilage Metabolism in Guinea Pig Articular Cartilage Explants." Matrix Biology. 21(2): 175–184.
7. Mittelstaedt. D., et al. 2011. "Quantitative Determination of Morphological and Territorial Structures of Articular Cartilage from Both Perpendicular and Parallel Sections by Polarized Light Microscopy." Connective Tissue Research. 52(6): 512–522.

Autores

Laura Lleras Forero, Gerente de Marketing de Produto, Pesquisa em ciências da vida, EMEA, Evident
Heiko Gäthje, Instrutor Sênior, Academia de formação, Evident