Análise espacial 3D de triagem de medicamentos de alto rendimento

Imagens 3D de alta velocidade de esferoides tumorais foram analisadas usando o software NoviSight™ para avaliar com precisão a eficácia do medicamento para várias amostras

Introdução

Avaliar o desempenho de um medicamento usando esferoides tumorais tridimensionais é importante porque os esferoides refletem o complexo microambiente do tumor. Isso permite que os pesquisadores avaliem a eficácia de um medicamento sob parâmetros que mais se assemelham ao ambiente natural de um tumor. Para realizar a triagem de medicamentos de alto rendimento usando esferoides, os pesquisadores devem usar um protocolo simples, produção de imagens semiautomática de alta velocidade e análise 3D de múltiplos poços. 
Neste estudo, realizamos um ensaio de viabilidade celular homogênea usando uma placa de 384 poços sem troca de líquido, tiramos imagens de alta velocidade usando o escâner ressonante do microscópio confocal FV3000RS e analisamos as imagens com o software NoviSight 3D. Os esferoides foram analisados em 3D para avaliar com mais precisão a eficácia do medicamento em várias amostras.
 

Fluxo de trabalho da aplicação

Benefícios

• Use um protocolo simples sem a necessidade de troca de líquido
• Capture imagens automaticamente usando um escâner ressonante de alta velocidade
• Analise com precisão várias amostras com análise espacial 3D
   

Métodos

Preparação de células

Células de câncer cervical HeLa foram semeadas em uma placa de fundo redondo de 384 poços Corning® (100 células por poço) e cultivadas por 24 horas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM — Dulbecco’s Modified Eagle Medium) com 10% de soro fetal bovino (FBS). A placa foi centrifugada suavemente para remover as bolhas de ar.

Preparação da amostra

Adicionamos os medicamentos cisplatina e estaurosporina (STS) às amostras em várias concentrações e as incubamos por 24 horas. Usando a diferença na permeabilidade da membrana, determinamos a viabilidade celular contando o total de células versus células mortas com o kit de produção de imagens de viabilidade celular da ReadyProbes™ a partir da Thermo Fisher Scientific® (células totais: azul/células mortas: verde). As amostras foram então coloridas e incubadas por cinco horas. Este método de preparação simples não requer nenhuma troca de líquido, fixação ou lavagem desde a semeadura celular até a geração de imagens.

Produção de imagens e análise

Obtivemos imagens fluorescentes de esferoides usando o microscópio confocal de varredura a laser FV3000RS com uma lente objetiva semiapocromática LUCPFLN20X. Depois de definir a área de produção de imagens, o escâner ressonante do microscópio capturou automaticamente as imagens. O software NoviSight™ pode importar dados de várias imagens emparelhadas com informações sobre a placa, como a posição do poço e a localização da amostra. Depois de importado, o software reconstrói as imagens em 3D. O software NoviSight pode reconhecer objetos, como núcleos e então analisar os vários sinais nos objetos.
 

Fig. 1 Método para triagem de medicamentos de alto rendimento sem troca de líquido
 

Resultados

Produção de imagens 3D de alta velocidade de várias amostras

Demorou cerca de um minuto para observar uma imagem de pilha Z de um único poço (2,33 μm de espessura, 122 fatias, 2 canais). O tratamento com cisplatina e STS aumentou o número de células mortas de uma maneira dependente da dose (Fig.  2^*). 

Fig.2 Produção de imagens de alta velocidade da resposta ao medicamento com esferoides^*
 

Análise 3D de alto rendimento da sensibilidade ao medicamento em esferoides

Os sinais celulares totais (azul) nos permitiram reconhecer os núcleos (Fig.  3A^*). Todas as células foram então classificadas em células vivas ou mortas com base na presença ou ausência de sinais verdes (sinais positivos: células mortas/sinais negativos: células vivas). Os sinais positivos e negativos foram classificados pela confirmação da imagem selecionada do diagrama (Fig.  3B^*). Após a classificação, você pode facilmente confirmar as intensidades totais dos sinais mortos em esferoides usando um mapa de calor no software (Fig.  4A). A porcentagem de células vivas em relação ao total de células foi calculada e representada graficamente (Fig.  4B). Os resultados mostraram que ambas as drogas eram altamente sensíveis às células HeLa.
 

(A)

(B)

Fig.  3 O software NoviSight™ pode reconhecer e classificar objetos com base em sinais^*
 

Fig.  4 Exibição do mapa de calor e curva de resposta à dose

Análise espacial de alto rendimento da sensibilidade ao medicamento

As imagens neste estudo foram capturadas tridimensionalmente para realizar análises espaciais avançadas. Usando o software NoviSight™, você pode definir a região direcionada para a análise. Configuramos o software para analisar o centro e a periferia de cada esferoide (Fig. 5A). Em seguida, realizamos uma análise populacional dentro dessas áreas. Este método permite a análise espacial da eficácia do medicamento para um grande número de esferoides em uma placa de múltiplos poços. O software então calculou a proporção de cada célula morta para o número de células nas áreas central e periférica (Fig.  5B). 
Neste caso, o número de células mortas no centro e na periferia aumentou de maneira dependente da dose. Em comparação com a cisplatina, a estaurosporina é eficaz na parte central do esferoide, mesmo em baixas concentrações.
 

Fig. 5 O software NoviSight pode realizar análises espaciais avançadas de regiões esferoides
 

Conclusão

Usando um protocolo simples, produção de imagens confocal e de alta velocidade e o software NoviSight, adquirimos imagens 3D de alto rendimento para classificar a viabilidade celular nos esferoides e analisar a resposta aos medicamentos. Esta técnica de análise espacial permite uma avaliação mais avançada dos medicamentos para várias amostras.

Autor

Hiroya Ishihara, Tecnologia de Avaliação Biológica 2, Pesquisa e Desenvolvimento

*Embora tenha se tornado uma das linhagens celulares mais importantes na pesquisa médica, é importante reconhecer que a contribuição de Henrietta Lacks para a ciência aconteceu sem o seu consentimento. Essa injustiça, embora tenha levado a descobertas importantes em imunologia, doenças infecciosas e câncer, também levantou discussões importantes sobre privacidade, ética e consentimento na medicina.
Para saber mais sobre a vida de Henrietta Lacks e sua contribuição para a medicina moderna, clique aqui.
http://henriettalacksfoundation.org/