Comparando linhas celulares iPS humanas usando o sistema de monitoramento de incubação CM20, Parte 3: reduzindo as variações de eficiência de diferenciação em organoides hepáticos entre linhas celulares iPS

Introdução

Os organoides são tecidos tridimensionais que podem ser criados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) humanas in vitro. Embora se espere que os organoides derivados de diferentes pacientes sejam estudados quanto às diferenças funcionais e individuais, a variabilidade dependente da linha iPS limita suas aplicações. O objetivo desta pesquisa é adotar o sistema de monitoramento de incubação CM20 para descobrir os indicadores morfométricos para definir a dependência do doador e do clone para a eficiência da formação de organoides.

Analisando os dados para cada proliferação de linha celular iPS humana adquiridos pelo monitor CM20

Em nossa pesquisa inicial, 12 linhas de células iPS humanas, derivadas de diferentes doadores, foram mantidas em um estado indiferenciado e monitoradas pelo sistema CM20 da Olympus. Graças ao monitoramento quantitativo de longo prazo do estado das células, descobrimos que linhas celulares iPS específicas apresentam diferenças em seu processo de crescimento e instabilidade na velocidade de crescimento entre passagens.

Na fase seguinte da pesquisa, diferenciamos as 12 linhas celulares iPS humanas em organoides hepáticos e nos questionamos se havia variabilidades na formação de organoides e na eficiência da diferenciação entre essas linhas celulares iPS. Revelamos que a eficiência da diferenciação subsequente em organoides é bastante afetada pelas diferenças na fase inicial de proliferação durante a cultura de manutenção. Contudo, as diferenças no tempo de duplicação entre as linhas celulares iPS não nos permitiram julgar se a qualidade dos organoides hepáticos formados é boa ou má.

A fim de progredir neste conhecimento para melhorar nossos métodos de diferenciação de organoides hepáticos, usamos os dados de crescimento celular durante as culturas de manutenção que foram adquiridos do monitor CM20 na primeira fase de nossa pesquisa. Focamos em duas linhas celulares iPS específicas com baixa eficiência de diferenciação de organoides hepáticos para explorar como se comportam de forma diferente de outras linhas celulares. Questionamo-nos se é possível melhorar a eficiência de diferenciação das células iPS resistentes à diferenciação modificando as condições de cultura de manutenção.

Resultados

Entre as 12 linhas celulares iPS testadas até agora, descobrimos que as linhas celulares I e J são resistentes à diferenciação na linhagem hepática. Para entender melhor as razões, usamos uma série de imagens adquiridas pelo monitor CM20 durante a fase inicial da cultura de manutenção e tentamos encontrar diferenças no comportamento das linhas celulares I e J comparando-as com as linhas celulares iPS que podem se diferenciar eficazmente na linhagem hepática.

Curiosamente, nas linhas celulares iPS capazes de se diferenciar (a linha L, por exemplo), foram formadas colônias a partir da maioria das células individuais aderidas após a passagem na fase inicial de proliferação. Por outro lado, observamos que houve uma maior taxa de morte celular após a adesão nas linhas celulares I e J, resultando em uma diminuição significativa na eficiência de formação de colônias (figura 1). Essa tendência foi observada de forma reprodutível em várias passagens. A partir dessas observações, levantamos a hipótese de que a maior frequência de mortes celulares nas fases iniciais da cultura de manutenção nas linhas celulares iPS resistentes à diferenciação causa um menor número de colônias de células iPS, o que acaba diminuindo sua eficiência de diferenciação em organoides hepáticos.

Para examinar isso, aumentamos o número de células cultivadas na passagem para que o número final de colônias fosse equivalente ao das linhas celulares iPS com capacidade de se diferenciar. Tentamos, então, induzir a diferenciação de organoides hepáticos desta cultura. Confirmamos que o aumento, em cerca de 5 a 10 vezes, do número de células cultivadas na passagem resultou em um aumento no número de colônias formadas na cultura de manutenção de células iPS resistentes à diferenciação em comparação com o protocolo padrão (figura 2A). Além disso, quando foram gerados organoides hepáticos a partir das linhas celulares I e J sob essas condições, obtivemos uma quantidade suficiente de organoides em comparação com as condições anteriores, em que poucos organoides foram formados (figura 2B). Descobrimos, também, que esses organoides hepáticos expressavam vários marcadores hepáticos. Estes resultados destacam a utilidade dos dados do monitor de cultura de células CM20 para melhorar a fase inicial da cultura de manutenção de células iPS resistentes à diferenciação e a diferenciação subsequente em organoides hepáticos.

Figura 1.Comportamento de linhas celulares iPS humanas na fase inicial da cultura de manutenção.

Figura 2. Efeito da densidade de cultivo na formação de organoides durante a manutenção de cultura de células iPS.
(A) Resultados de monitoramento do CM20 do processo de crescimento de três linhas celulares iPS humanas sob condições normais e da cultura de manutenção sob condições com aumento do número de células cultivadas.
(B) A formação da indução da diferenciação de organoides é realizada após a cultura de manutenção das linhas celulares I e J, mostrando resistência à diferenciação sob a condição de aumento do número de células cultivadas. Para efeitos de comparação, os organoides derivados da linha L, uma linha celular iPS com capacidade de se diferenciar, são mostrados quando a linha L é mantida sob condições padrão e então induzida a se diferenciar.

Conclusão

Os pesquisadores que trabalham com organoides costumam concentrar a maior parte de seus esforços em otimizar os protocolos de diferenciação de organoides a partir de células iPS. Ao comparar organoides derivados de várias linhas celulares iPS, a maioria dos pesquisadores raramente presta atenção a suas culturas de manutenção. Esta pesquisa revelou que a fase inicial de proliferação durante a cultura de manutenção de células iPS influencia bastante a eficiência de indução de diferenciação subsequente. Isso sugere que, além do desenvolvimento de um protocolo de diferenciação de organoides, a otimização dos protocolos individuais de cultura de manutenção de células iPS é crucial para gerar de forma reprodutível várias amostras de organoides. Ao utilizar o sistema de monitoramento CM20, que é capaz de armazenar e gerenciar quantitativamente dados de cultura de séries temporais longitudinais, podemos adquirir novos conhecimentos e melhorar nossos protocolos experimentais.

Cometários dos Drs. Takebe e Yoneyama