Imagerie en fluorescence, contraste de phase et bioluminescence de cellules vivantes incubées dans des boîtes à fond en plastique à l’aide d’un objectif 20x à contraste de phase et grande ouverture numérique (ON)

Introdução
Formação de imagens de células-tronco incubadas em placas com fundo de plástico

As placas para cultura com fundo de vidro usadas para a observação com fluorescência de células vivas são geralmente comercializadas por muitos fabricantes de câmaras de incubação. Contudo, alguns tipos de células não podem ser cultivados adequadamente em uma superfície de vidro e requerem o uso de placas com fundo de plástico.
Certos tipos de células-tronco, como as células iPS (células-tronco pluripotentes induzidas) e as células ES (células-tronco embrionárias), podem ser diferenciados melhor em células-alvo quando cultivados em um substrato de plástico. Na verdade, alguns tipos de células não podem ser diferenciados em células-alvo quando incubados em placas com fundo de vidro. Contudo, a desvantagem de usar placas com fundo de plástico é que a obtenção de imagens de fluorescência costuma ser complicada pela autofluorescência produzida pelo material plástico, resultando em um alto grau de sinal de fundo. Quando isso acontece, a relação sinal/ruído é prejudicada e se torna mais difícil obter imagens da amostra fluorescente.
Os pesquisadores de células-tronco desejam poder realizar uma observação com fluorescência vívida enquanto usam placas com fundo de plástico. Em resposta a essa necessidade, a Olympus desenvolveu uma lente objetiva de contraste de fase com alta AN de 20X (UCPLFLN20XPH), na qual a abertura numérica foi consideravelmente melhorada em comparação com uma lente objetiva de contraste de fase de 20X convencional. A abertura numérica melhorada produz uma melhor relação sinal/ruído, possibilitando imagens de fluorescência melhores com placas de plástico. Consequentemente, os pesquisadores podem observar mais eficazmente o processo de diferenciação de células-tronco com imagens de fluorescência com lapso de tempo e avaliar mais facilmente a taxa de confluência ou transfecção das células cultivadas em placas com fundo de plástico.
Nesta nota de aplicação, demonstramos como a lente objetiva de contraste de fase com alta AN de 20X da Olympus possibilita a observação vívida de fluorescência e contraste de fase das células-tronco em uma placa com fundo de plástico, bem como exemplificamos a observação de imagens de bioluminescência usando a mesma lente objetiva.

Aplicação: observação de fluorescência e contraste de fase usando as lentes objetivas de contraste de fase com alta AN de 20X da Olympus

Foram incubadas células-tronco embrionárias (ES) de camundongo com histona marcada com GFP (GFP-H2B) nos núcleos em placas com fundo de plástico. As imagens dessas células foram obtidas com uma lente objetiva de contraste de fase de 20X convencional (AN = 0,4) e, em seguida, comparadas a imagens obtidas com uma lente objetiva de contraste de fase com alta AN (AN = 0,7) de 20X da Olympus.

Células ES de camundongo com expressão de GFP-H2B

Quando as imagens acima são comparadas, as imagens de fluorescência clara foram obtidas com a lente objetiva de contraste de fase com alta AN de 20X (UCPLFLN20XPH) e os nucléolos são facilmente observados. Isso se deve ao fato de que as objetivas possuem uma abertura numérica melhorada ao mesmo tempo que mantêm uma longa distância de trabalho (DT: 0,8–1,8 mm).
Essas imagens demonstram que as imagens de fluorescência comparáveis às obtidas usando placas com fundo de vidro podem ser adquiridas quando a objetiva UCPLFLN20XPH é usada. Com a ajuda de um colar de correção, a aberração esférica gerada devido a diferenças na espessura do fundo da placa de plástico pode ser corrigida facilmente.

Condições fotográficas:
Espécime: células ES de camundongo
Marcação de fluorescência: GFP-H2B
Câmara de incubação: placa com fundo de plástico
Lente objetiva: lente objetiva de contraste de fase com alta AN UCPLFLN20XPH
CCD Câmera: câmera digital DP80 para microscópio
Microscópio: microscópio para pesquisa invertido IX73

Aplicação: aumentar a sensibilidade de fluorescência da câmera digital DP80 com CCD usando o modo CCD monocromático

Tal como descrito anteriormente, a lente objetiva de contraste de fase com alta AN de 20X da Olympus (UCPLFLN20XPH) possibilitou uma observação vívida de fluorescência e contraste de fase das células incubadas em uma placa com fundo de plástico. Contudo, quando uma placa é repetidamente tirada da incubadora para verificar a fluorescência do espécime durante os experimentos, é necessário minimizar a fototoxicidade produzida pela luz de excitação. Nesse caso, o uso de uma câmera com CCD de alta sensibilidade pode reduzir a intensidade da luz de excitação ao mesmo tempo que reduz o tempo que a amostra fica exposta à luz potencialmente citotóxica.
A câmera digital DP80 para microscópio da Olympus oferece a dupla funcionalidade de reprodutibilidade de cores e formação de imagens com CCD monocromático de alta sensibilidade. Ao usar o modo CCD monocromático da DP80 em conjunto com a lente objetiva de contraste de fase com alta AN de 20X (UCPLFLN20XPH), o Nanog-GFP expresso em células iPS de camundongo foi detectado eficientemente a uma intensidade de luz mais baixa, tal como ilustrado pelas imagens a seguir.

Nanog-GFP expresso em células iPS de camundongo

Condições fotográficas:
Espécime: células iPS de camundongo
Marcação de fluorescência: Nanog-GFP
Câmara de incubação: placa com fundo de plástico
Lente objetiva: lente objetiva de contraste de fase com alta AN UCPLFLN20XPH
CCD Câmera: câmera digital DP80 para microscópio
Microscópio: microscópio para pesquisa invertido IX73

Aplicação: formação de imagens de bioluminescência de alto de desempenho

A lente objetiva de contraste de fase com alta AN de 20X da Olympus (UCPLFLN20XPH) alcança um desempenho excelente em aplicações exigentes, como a formação de imagens de bioluminescência com placas com fundo de plástico. A formação de imagens de bioluminescência possibilita que o usuário detecte quantitativamente a expressão gênica a nível unicelular. Essa modalidade de formação de imagens pode ser realizada facilmente com o Olympus LV200, um microscópio concebido especificamente para a formação de imagens de bioluminescência. Quando a objetiva UCPLFLN20XPH é usada com o LV200, é possível observar várias células em um único campo. Como mostrado na imagem a seguir, o contraste de fase e a bioluminescência Nanog-Luc (amarelo) podem ser facilmente visualizados em células ES de camundongo com alta sensibilidade a nível unicelular.

Condições fotográficas:
Espécime: células ES de camundongo
Bioluminescência: Nanog-Luc
Câmara de incubação: placa com fundo de plástico
Lente objetiva: lente objetiva de contraste de fase com alta AN UCPLFLN20XPH
Microscópio: sistema de formação de imagens de bioluminescência LV200

Conclusão

Os exemplos debatidos demonstram que a objetiva de contraste de fase com alta AN de 20X da Olympus (UCPLFLN20XPH) permite obter imagens vívidas de fluorescência, contraste de fase e bioluminescência de células cultivadas em placas com fundo de plástico. A lente objetiva UCPLFLN20XPH é compatível com o compensador de desvio Z IX3-ZDC2 e com a série IX3 de microscópios para pesquisa invertidos motorizados. Quando equipado com uma platina motorizada, é possível configurar facilmente um sistema de ensaio baseado em células totalmente motorizado para placas com fundo de plástico.