Qual a idade do peixe? – Como usar um escâner de lâminas para pesquisa SLIDEVIEW™ VS200 para superar os desafios da inspeção de otólitos de peixes

Introdução

Peixes do gênero Clupea, também conhecidos como arenques, tiveram papel essencial na história da pesca marinha no Atlântico Norte, e seu estudo foi fundamental para a evolução da ciência da pesca no início do século XX (Figura 1). Esse peixe gorduroso também tem uma longa história como um importante alimento.

O arenque costuma se deslocar em grandes cardumes em torno da costa e próximo ao litoral, e ele é encontrado principalmente em águas rasas e temperadas dos Oceanos Pacífico Norte e Atlântico Norte, incluindo o mar Báltico, assim como na costa oeste da América do Sul. Existem três espécies de Clupea conhecidas, as quais fornecem cerca de 90% de todos os arenques capturados em pescarias.

_{Figura 1. Arenque.}

Estudos sobre a idade e o crescimento dos peixes são importantes para ajudar a entender o período e a magnitude da desova, o recrutamento, a utilização do habitat e a duração do período larval e que antecede a fase adulta, além da estrutura de idade da população. Esse conhecimento é, por sua vez, importante para desenvolver políticas adequadas de gestão de pesca. Determinar a idade de um peixe é possível por meio da contagem dos anéis dos otólitos.

_{Figura 2. Otólito de um arenque.}

Os otólitos dos peixes acumulam camadas de carbonato de cálcio e de matriz gelatinosa ao longo de suas vidas. A taxa de acúmulo varia de acordo com o crescimento dos peixes, normalmente com crescimento menor no inverno e maior no verão, o que resulta no surgimento de algo parecido com três anéis. Por meio da contagem dos anéis, é possível determinar a idade de um peixe em anos. Além disso, na maioria das espécies, o acúmulo de carbonato de cálcio e de matriz gelatinosa se alterna em um ciclo diário, o que torna possível determinar a idade de um peixe em dias. Essas informações devem ser obtidas usando um microscópio e elas fornecem dados importantes para estudos sobre o histórico de vida inicial.

Experimento

Pesquisadores extraíram otólitos, os incrustaram em resina acrílica e os trituraram até uma espessura de aproximadamente 50 μm.

Tradicionalmente, um microscópio vertical manual equipado com recursos de luz polarizada foi usado para visualizar o otólito e contar os anéis diários.

A visibilidade das camadas individuais (anéis) muda com diferentes focos e torna esse método demorado, pois o observador precisa reajustar o foco no otólito constantemente.

O escâner de lâminas Olympus SLIDEVIEW VS200 pode ser usado para automatizar a captura de imagens de um otólito, o que economiza uma quantidade significativa de tempo (Figura 3). O sistema pode ser configurado para adquirir uma pilha Z com até 31 planos em ampliações diferentes com luz polarizada ou campo claro. Em iluminação transmitida em campo claro, o diafragma de abertura motorizada pode ser ajustado para melhorar o contraste por meio do fechamento da abertura em relação à abertura numérica da objetiva. (Figura 4A)

_{Figura 3 O escâner de lâminas para pesquisa Olympus SLIDEVIEW VS200.}

Resultados

O otólito de um espécime jovem tem um diâmetro de aproximadamente 75 μm. O otólito de um adulto tem um diâmetro de aproximadamente 1.180 μm. A imagem 4B foi capturada usando microscopia de luz polarizada, que é projetado para observar espécimes que são visíveis principalmente devido ao seu caráter opticamente anisotrópico. O escâner deve ser equipado com um polarizador posicionado no caminho da luz antes do espécime e um analisador (segundo polarizador) na trajetória óptica entre a abertura traseira da objetiva e a porta da câmera. O contraste da imagem vem da interação da luz polarizada pelo plano com um espécime birrefringente (ou com refração dupla) para produzir dois componentes de onda individuais que sejam polarizados em planos mutualmente perpendiculares.

Ao focar no centro de um otólito, os anéis são muito mais densos do que a parte externa. Esse fenômeno fica claramente visível nas Figuras 5A e 5B. As imagens também demonstram a importância da aquisição de imagens em vários planos Z (uma pilha Z), já que a visibilidade dos anéis muda em diferentes níveis.

O sistema VS200 automatiza a aquisição de imagens do otólito, o que libera os usuários da tarefa tediosa de realizar o foco e a aquisição de modo manual. Considerando que as imagens são digitalizadas, é possível criar um programa de análise de imagem digital totalmente automatizado para contar as camadas do otólito e calcular a idade.

Figura 5A. Um recorte do centro da pilha Z do otólito de um espécime jovem. Os planos Z individuais são mostrados conforme sua posição Z em μm (começando da parte superior esquerda até a parte inferior direita). A distância entre cada plano Z é de 1,17 μm. A pilha Z abrange uma distância de 20 μm e o espaço entre as camadas do otólito na parte central é de apenas cerca de 600 nm.

Figura 5B. Um recorte do centro da pilha Z do otólito de um espécime adulto. Os planos Z individuais são mostrados conforme sua posição Z em μm. A distância entre cada plano Z é de 1,17 μm. A pilha Z abrange uma distância de 34 μm e o espaço entre as camadas do otólito na parte central é de cerca de 740 nm.

Conclusão

O escâner de lâminas para pesquisa SLIDEVIEW VS200 oferece uma forma fácil e conveniente de adquirir imagens de otólitos de peixes incrustados em resina. Em peixes jovens, a distância da camada do otólito é de apenas cerca de 600 nm, o que exige um sistema de formação de imagens de alta capacidade de ampliação e resolução. Utilizar uma objetiva UPlanXApo de 40x com um AN de 0,95, o sistema VS200 oferece a ampliação e resolução necessárias para capturar essas imagens.

Espécimes de otólitos de adultos também são relativamente espessos (até 34 μm) e não muito transparentes, já que são feitos de carbonato de cálcio. O sistema VS200 tem recursos avançados que podem superar esses desafios e obter imagens de alta qualidade. Para amostras espessas, o sistema consegue escanear a amostra em vários planos Z com luz polarizada. Para melhorar o contraste em amostras de otólito, a abertura do diafragma do sistema pode ser fechada para deixar os anéis de idade mais visíveis e facilitar a contagem.

Agradecimentos

Esta nota de aplicação foi preparada com a colaboração do Dr. Bastian Huwer, Instituto Nacional de Recursos Aquáticos, Seção de Pesquisas Sobre a Vida Marinha, Lyngby, Dinamarca