Formação de imagem de intervalo de tempo estendido da motilidade e proliferação celular usando FLUOVIEW FV3000 e o sistema de compensação de desvio Z TruFocus da Olympus

Os ensaios de formação de imagem com base em cultura de células são pilares fundamentais para a investigação de diversos fenômenos biológicos. Com o uso desta técnica, os pesquisadores podem observar a proliferação e dinâmica celular com o passar do tempo. Como as populações de células podem exibir perfis de expressão de proteínas localmente diversos e padrões de motilidade, os ensaios de formação de imagem precisam ser cuidadosamente projetados para evitar tendências e resultados distorcidos criados por amostragem insuficiente. Desta forma, os experimentos de formação de imagem com base em cultura de células devem ser projetados para acomodar vários campos de visão através do poço de microplacas ou dispositivo de cultura. Esta nota de aplicação mostra como o microscópio FV3000 pode facilitar a captura de imagens de intervalo de tempo de diversas áreas com parâmetros de aquisição complexos para conjuntos de dados completos e consistentes de um único experimento.

Captura de vários campos de visão em um único experimento

Neste experimento, o módulo de intervalo de tempo de múltiplas áreas (MATL) do microscópio confocal FV3000 foi usado para monitorar continuamente a motilidade e a proliferação de populações de células endoteliais da veia do cordão umbilical humano (HUVEC) que expressam a proteína fluorescente verde (GFP) citosólica durante um período de aproximadamente 12,5 horas. Ao desenvolver o experimento, foi importante monitorar diversas regiões com vários aumentos e parâmetros de pilha Z para rastrear a dinâmica celular individual, bem como a dinâmica da população como um todo. Como o módulo MATL permite que parâmetros XYZT independentes sejam registrados para cada posição ou área ladrilhada, foi fácil programar várias condições de formação de imagem para diversas regiões com diferentes aumentos e parâmetros de pilha Z com o passar do tempo.

_{Figura 1. Esquema de experimento de intervalo de tempo de diversas áreas. Para cada poço na placa de poços, foram programadas várias posições de áreas individuais e ladrilhadas com diferentes aumentos independentes e parâmetros de pilha Z. Essas posições registradas foram fotografadas por 12 horas e 25 minutos.}

Uso do foco automático específico do local para rastrear a motilidade e a proliferação das células HUVEC

Um dos maiores desafios na formação de imagens de múltiplas áreas com o passar do tempo é a tendência de mudança de foco gradual devido a pequenas flutuações na temperatura do ambiente da sala do microscópio. Além disso, a distância entre a superfície da lamínula e o tecido da amostra pode variar na área de superfície, sendo ainda mais desafiador obter imagens nítidas em diversos campos de visão. O sistema de compensação de desvio Z TruFocus combate esses problemas usando um laser infravermelho próximo não fototóxico para localizar a interface da lamínula e amostra e determinar a posição focal correspondente. Ao combinar o sistema TruFocus com o recurso MATL, é simples registrar várias posições XYZT independentes com autofoco específico do local.

Neste experimento, foram alternadas diversas regiões com diferentes aumentos e parâmetros de pilha Z com o passar do tempo para rastrear mudanças na motilidade e proliferação das HUVECs, tanto no nível de célula individual quanto a nível de população. Conforme mostrado nos destaques do vídeo na Figura 2, a combinação de MATL com o sistema TruFocus possibilitou imagens repetidas de vários poços, mantendo o foco nítido ao longo do experimento de 12 horas.

_{Figura 2. Formação de imagem de intervalo de tempo de múltiplas áreas XYZT de HUVECs que expressam GFP citosólica. São mostradas 4 imagens de amostra de posições diferentes com parâmetros de aquisição variados. O sistema TruFocus foi colocado para manter a amostra em foco em vários campos de visão durante o experimento de 13 horas.}

Condições da formação de imagem

Dois painéis principais:
objetiva UPLXAPO20X
Microscópio: microscópio confocal de escaneamento a laser FLUOVIEW FV3000RS
Laser: 488 nm (GFP, verde)
Scanner: ressonante
Série Z: 16 etapas
Número total de áreas rastreadas: 14

Dois painéis inferiores:
objetiva UPLXAPO10X
Microscópio: microscópio confocal de escaneamento a laser FLUOVIEW FV3000RS
Laser: 488 nm (GFP, verde)
Scanner: ressonante
Série Z: 15 etapas
Número total de áreas rastreadas: 48

Tempo total do experimento: 13 horas e 11 minutos.

Como o microscópio confocal FV3000 facilitou nosso experimento

Manter o foco durante intervalos de tempo em diversas áreas com o sistema de compensação de desvio Z TruFocus da Olympus

O sistema de compensação de desvio Z TruFocus (ZDC) é um módulo totalmente motorizado que combate o desvio focal para manter a amostra em foco nítido durante experimentos de intervalo de tempo a longo prazo. O sistema TruFocus aumenta as capacidades de aplicação, suportando um grande número de objetivas e tipos de recipientes, inclusive placas com fundo de vidro e plástico. Isso permite que os usuários gerem dados de intervalo de tempo nítidos, focados e contínuos sob várias condições de formação de imagem, sem se preocuparem com o desvio Z.

O módulo de software de intervalo de tempo de diversas áreas (MATL) permite parâmetros XYZT independentes O módulo de software de intervalo de tempo de diversas áreas (MATL) controla a etapa XY motorizada do microscópio FV3000, permitindo parâmetros XYZT independentes para cada posição registrada ou área ladrilhada. O módulo MATL fornece dados de intervalo de tempo preciso e consistente por meio da integração completa do hardware e temporização precisa fornecida pelo microscópio invertido FV3000, tornando o sistema adequado para a formação de imagem de diversos materiais de cultura de fundo de vidro comercialmente disponíveis ou até mesmo dispositivos e microplacas personalizados.

Comentário do Dr. James Hoying Trabalhamos com diversos modelos de tecido vascularizado em 3D dispostos em muitos poços de placas de vários poços. O sistema TruFocus e os recursos MATL do microscópio FV3000 são valiosos, pois muitas vezes precisamos fazer medições de vascularidade e morfologia dos vasos em dezenas de tecidos ao mesmo tempo, usando imagens confocais de alta resolução das vasculaturas em 3D.

Agradecimentos

Esta nota de aplicação foi preparada com a ajuda do pesquisador:

Dr. James Hoying, Cientista-chefe, Advanced Solutions Life Sciences