Imagem volumétrica dinâmica com o microscópio confocal FV3000RS: reconstrução 3D da dinâmica da actina em um esporo de Colletotrichum graminicola

Colletotrichum graminicola é um patógeno fúngico amplamente difundido e um dos principais agentes causadores de doenças em culturas de cereais, incluindo trigo e milho. No milho, as infecções fúngicas de C. graminicola causam a queima das folhas da antracnose, resultando em graves danos à lavoura e grandes perdas econômicas para os agricultores. Compreender a dinâmica do citoesqueleto na germinação de esporos de C. graminicola pode, portanto, contribuir para a prevenção de doenças.

Organização de pré-germinação de cabos de actina filamentosos

Neste experimento, o microscópio FLUOVIEW FV3000RS foi usado para estudar a dinâmica da actina de um esporo de C. graminicola antes da germinação. Cabos de actina filamentosos podem ser observados dentro de um esporo em forma de crescente que ainda não germinou. Os cabos foram organizados para se estenderem longitudinalmente ao longo do esporo no plano de contato com a superfície. Os cabos de actina podem ser vistos retraindo do centro em direção a cada extremidade do esporo.

Figura 1: Reconstrução XYZT da dinâmica da actina em um esporo de C. graminicola antes da germinação.

Condições de imagem
Objetiva: objetiva a óleo 100X 1.49NA TIRF (UAPON100XOTIRF)
Microscópio: microscópio confocal de varredura a laser FLUOVIEW FV3000
Lasers: 488 nm (GFP, verde), 561 nm (DIC, cinza)
Escâner: Escâner ressonante
Quadros XY: 0,272 s/quadro
Série Z: 22 etapas (6 s/seção)
Série T: 30 planos Z adquiridas ao longo de 3 minutos

Observação de dois eventos citoesqueléticos distintos durante a germinação

Seguindo a organização da actina em cabos, o processo de germinação de um esporo de C. graminicola é marcado por dois eventos citoesqueléticos sucessivos, com a formação de manchas e cabos durante ambos os eventos. No primeiro evento, o citoesqueleto se reorganiza para formar um septo que delineia o esporo do fungo em duas células distintas (representadas pela barreira medial ao longo da largura do esporo). Após o evento de septação, os cabos de actina se formam no local da germinação e se estendem pelo tubo germinativo em desenvolvimento em direção ao ápice. Esses dois eventos podem ser vistos nas Figuras 2 e 3.

Figura 2: XYZT de formação de parede cruzada durante um evento de septação em um esporo em germinação de C. graminicola, seguido pela formação de um tubo germinativo.

Condições de imagem
Objetiva: objetiva a óleo 100X 1.49NA TIRF (UAPON100XOTIRF)
Microscópio: microscópio confocal de varredura a laser FLUOVIEW FV3000
Lasers: 488 nm (GFP, verde), 561 nm (DIC, cinza)
Escâner: Escâner ressonante
Quadros XY: 0,470 s/quadro
Série Z: 31 etapas (5,35 s/plano)
Série T: 34 planos Z adquiridas em intervalos de 1 minuto ao longo de 33 minutos

Figura 3: reconstrução 3-D do citoesqueleto de actina em um esporo em germinação de C. graminicola, no qual o tubo germinativo em desenvolvimento pode ser visto claramente. 

Condições de imagem
Objetiva: objetiva a óleo 100X 1.49NA TIRF (UAPON100XOTIRF)
Microscópio: microscópio confocal de varredura a laser FLUOVIEW FV3000
Lasers: 488 nm (GFP, verde), 561 nm (DIC, cinza)
Escâner: Escâner Galvano
Seções Z: 17 etapas

Como o microscópio confocal FV3000 facilitou nosso experimento

Manter o foco durante lapsos de tempo quadridimensionais com o sistema de compensação TruFocus Z da Olympus

O sistema de compensação TruFocus Z avançado (ZDC) facilita a aquisição de várias planos Z sequenciais sem desvio na dimensão Z. Isso permite que os usuários gerem lapsos de tempo claros, focados e contínuos em três dimensões, o que permite aos pesquisadores interrogar a dinâmica da proteína em toda a amostra sem se preocupar com o desvio Z.

Aquisição quadridimensional rápida com o escâner ressonante

O microscópio FV3000RS possui um escâner ressonante de alto desempenho que permite a aquisição rápida de lapsos de tempo da dinâmica de células vivas. O escâner ressonante no microscópio FV3000RS também mantém um campo de visão 1X completo com FN 18, com velocidades de imagem de 30 quadros por segundo a 512 × 512 píxeis. Usando o escâner ressonante, os pesquisadores podem adquirir planos Z de vários planos em segundos, alcançando planos Z de alta resolução de fenômenos que ocorrem rapidamente em células vivas.

Os detectores TruSpectral GaAsP fornecem alta sensibilidade para imagens de células vivas

Integrado em todos os microscópios confocais FV3000, a tecnologia de detecção TruSpectral permite maior rendimento de luz em comparação com as unidades de detecção espectral convencionais. O holograma de fase de volume difrata a luz com uma eficiência de transmissão até três vezes maior do que as grades de reflexão. Quando combinado com GaAsP PMTs de alta eficiência, o detector espectral de alta sensibilidade (HSD) do microscópio FV3000 requer potência de laser mínima para obter imagens de alto sinal-ruído, permitindo imagens de células vivas poderosas, porém suaves.

Comentário de Joseph Vasselli e Dr. Brian Shaw

Nossa pesquisa tem o objetivo de compreender o papel do citoesqueleto e das proteínas endocíticas no crescimento e desenvolvimento de fungos filamentosos. Rastrear a localização espaço-temporal dessas proteínas durante as mudanças na polaridade de crescimento é crucial para nossos experimentos. A excelente compensação de desvio Z do microscópio FV3000, os detectores de alta sensibilidade e o escâner ressonante rápido nos permitem adquirir XYZTs de alta resolução para interrogar com eficácia a dinâmica dessas proteínas em células vivas.

Agradecimntos

Esta nota de aplicação foi preparada com a ajuda dos seguintes pesquisadores: