Formação de imagem da resposta a medicamentos na avaliação da eficácia de medicamentos

Índice

1. Formação de imagem da resposta a medicamentos esferoides (flutuação de íons de cálcio)
2. Observação de múltiplos pontos de quimiluminescência de placas multipoços
3. Observação a longo prazo através da perfusão do meio e adição automatizada de substrato
4. Observação da embriogênese de mosca da fruta

1. Formação de imagem da resposta a medicamentos esferoides (flutuação de íons de cálcio)

Organoides e esferoides (agregados de células) são modelos 3D que muitas vezes respondem de formas que se assemelham muito mais a um tecido vivo do que a avaliação convencional usando culturas de células 2D. Há uma necessidade cada vez maior de organoides e esferoides na pesquisa de desenvolvimento de medicamentos para aplicações de avaliação da eficácia de medicamentos. De forma semelhante, o interesse na formação de imagem de luminescência, que envolve o uso de proteínas de luminescência (LP) em vez de proteínas de fluorescência (FP) está em alta devido às vantagens, que incluem uma fototoxicidade reduzida e a ausência de ruído de fundo de fluorescência.

Para a investigação dos ligantes receptores de células GPCR, que são um grupo molecular alvo principal para produtos farmacêuticos, as flutuações de concentração de íons de cálcio são frequentemente usadas como indicador. Uma vez que, ao contrário da fluorescência, a quimiluminescência (CL) não requer luz de excitação, a autofluorescência dos esferoides e de outras estruturas não é uma preocupação. Devido a essa característica das sondas de CL, a formação de imagem de CL tem o potencial de ser usada para medir as flutuações da concentração de íons de cálcio em esferoides, mantendo ao mesmo tempo uma alta relação sinal-ruído (SNR) e uma alta quantificação. Assim, os sensores de luminescência de cálcio de nanolanternas verdes realçadas (eNL), GeNL (Ca2+)_520 (41), foram introduzidos nos esferoides criados usando células cultivadas. Após a estimulação com histamina, que é um ligante receptor GPCR H1 para esferoides, foi realizada uma tentativa de observação contínua a longo prazo das flutuações da concentração de íons de cálcio internas das células (21). O resultado foi a observação bem-sucedida dos sinais luminosos do GeNL(Ca2+)_520 com uma alta SNR por um período de 50 minutos (Figura 2).

Condições de observação
Células HEK293T: cultivadas por uma semana em uma placa de base U multipoços de 96 poços com vírus adenoassociado transientemente introduzido com sensores de íon de cálcio de luminescência ((GeNL(Ca2+)_520))
Recipiente de observação: placa multipoços, 96 poços, base U
Meio de observação: DMEM/F-12 (Gibco) + FBS a 10%
Substrato luminescente: 10 µm de furimazina (Promega)
Estimulação celular: 2 µm de histamina
Microscópio: sistema de formação de imagem de luminescência* baseado no sistema IXplore™ Live
Lente objetiva: UPLSAPO20X (AN 0,75), adaptador de câmera: 0,5x
EM-CCD: Andor iXon Ultra 888 (Ganho EM 1000x), tempo de exposição: 20 segundos/foto, fixação: 1 × 1
 

Figura 2. Medições das flutuações da concentração de íons de cálcio causadas pela estimulação com histamina

2. Observação de múltiplos pontos de quimiluminescência de placas multipoços

Durante a triagem de moléculas candidatas a novos medicamentos da biblioteca de compostos, é necessário realizar uma análise de alto conteúdo das células semeadas em uma placa multipoços para testar múltiplos fenótipos celulares, tais como a concentração intracelular de íons e as mudanças na morfologia celular. Nesse caso, o uso de proteínas quimiluminescentes de alta luminosidade é eficaz porque pode capturar quantitativamente as mudanças na morfologia e movimento celular com alto contraste.

Usando a formação de imagem de quimiluminescência para a triagem de medicamentos e avaliação da eficácia, semeamos as células cultivadas que expressavam proteínas quimiluminescentes em uma placa multipoços. Foi realizado um escaneamento automatizado e repetido de múltiplos pontos em cada poço usando uma platina motorizada, e foi realizada uma análise dos dados de imagem adquiridos para todos os poços. Isso permitiu a aquisição de imagens da placa multipoços inteira em apenas alguns minutos. Como resultado, conseguimos observar com sucesso imagens de baixa ampliação dos poços das microplacas, bem como imagens de alta ampliação da morfologia das células individuais com alto contraste. Imagens das células com campos de visão variando de 1 mm a 100 µm são mostradas na Figura 3. Nosso experimento demonstrou que é possível obter análises de células de alto rendimento e alto conteúdo usando um sistema de formação de imagem de quimiluminescência que incorpora um microscópio com capacidade de realizar escaneamento de múltiplos pontos.

Condições de observação
Células HeLa: expressão estável da proteína de quimiluminescência de alto brilho, sensor de nanolanternas amarelas realçadas
Recipiente de observação: placa multipoços, 96 poços, base plana
Meio de observação: HBSS(-) (Sigma)
Substrato luminescente: 10 µm de furimazina (Promega)
Microscópio: sistema de formação de imagem de luminescência* baseado no sistema IXplore Live Lente objetiva: UPLFLN10X2PH (AN 0,3), adaptador de câmera: 0,5xbr/> EM-CCD: Andor iXon Ultra 888 (Ganho EM 1000x), tempo de exposição: 1 segundo/foto, fixação: 2 × 2

Figura 3. Células cultivadas em placas multipoços a 1 mm, 500 µm e 100 µm capturadas usando formação de imagem de luminescência com escaneamento de múltiplos pontos

3. Observação a longo prazo através da perfusão do meio e adição automatizada de substrato

Para a finalidade de avaliação da eficácia de medicamentos, a observação de longa duração das células é essencial para uma análise detalhada dos efeitos. Devido ao curto tempo de maturação e meia vida característicos da luciferase, há muito tempo elas são reconhecidas como genes repórteres eficazes para monitorar a dinâmica da expressão gênica ao longo do tempo. Além disso, uma vez que não é necessária luz de excitação, como é com a fluorescência, ao usar sondas luminescentes para aplicações de formação de imagem a longo prazo, a fototoxicidade é reduzida. No entanto, uma vez que esta técnica requer um substrato luminescente (luciferina), um fornecimento estável de luciferina para as células é importante.

A luciferina do tipo coelenterazina tem um brilho especialmente elevado, porém, uma vez que ela oxida na célula em um curto espaço de tempo, a adição no momento certo é essencial para aplicações de observação a longo prazo. Para resolver esse problema, perfundimos as células com proteína luminescente de alta intensidade, enquanto um dispositivo de adição automatizada de substrato adicionava a coelenterazina para que a luminescência pudesse ser monitorada constantemente. Como resultado, conseguimos monitorar com sucesso a imagem luminescente em combinação com a formação de imagem de contraste de fase por mais de 24 horas (Figura 4).

Condições de observação
Células HeLa†: expressão estável da proteína de quimiluminescência, nanolanterna amarela realçada
Recipiente de observação: placa de fundo de vidro de 35 mm
Meio de observação: DMEM/F12 (Gibco) + FBS a 10%
Substrato luminescente: 2,5 mM de coelenterazina-h (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.), 1,2 µl/7,5 minutos
Taxa de fluxo da perfusão: 40 µl/minuto, drenagem do meio: aprox. 10 ml/hora
Microscópio: sistema de formação de imagem de luminescência* baseado no sistema IXplore Live
Lente objetiva: UPLFLN40XPH (AN 0,75), adaptador de câmera: 0,5x
EM-CCD: Andor iXon Ultra 888 (Ganho EM 1000x), tempo de exposição: 5 minutos/foto, intervalo de captura: 7,5 minutos, fixação: 1 × 1

4. Observação da embriogênese de mosca da fruta

A avaliação da eficácia de medicamentos usando organismos modelo é essencial para avançar para o estágio seguinte dos ensaios clínicos. Nos últimos anos, as moscas ganharam atenção por serem um excelente material para a pesquisa de doenças humanas. Por exemplo, o Vandetanib, um medicamento que foi descoberto através do desenvolvimento e uso de um modelo de câncer medular de tireoide de mosca, foi aprovado como medicamento de tratamento para humanos pela FDA.

Embora as proteínas fluorescentes sejam muitas vezes usadas como repórteres para o monitoramento da expressão gênica em organismos modelo vivos, vários problemas precisam ser considerados, incluindo a transmissão de luz dos embriões e a autofluorescência em resposta à luz de excitação. A formação de imagem de luminescência, por outro lado, não requer luz de excitação, o que elimina a maioria desses problemas. Para este experimento, larvas em estágio de terceiro ínstar foram alimentadas com D-Luciferina misturada com pasta de levedura, e as mudanças na expressão gênica engrailed através do processo de embriogênese da mosca da fruta foram monitoradas ao longo do tempo usando este composto como um repórter. Os resultados mostraram que foi possível detectar a luminescência no fundo da crisálida, através da casca da pupa, e conseguimos observar em tempo real as mudanças nos locais de expressão e no nível de expressão durante o processo de transformação (Vídeo 2).

Vídeo 2. Formação de imagem de luminescência de embriões de mosca da fruta (escala gráfica: 500 µm)

Condições de observação
Mosca da fruta: repórter de luminescência da expressão gênica engrailed (luciferase: Pmat)
Após administrar a D-Luciferina misturada com pasta de levedura para a larva em terceiro ínstar, as pupas foram colocadas em uma placa de 24 poços para observação
Microscópio: sistema de formação de imagem de luminescência* baseado no sistema IXplore Live Lente objetiva: UPLFLN4XPH (AN 0,13), adaptador de câmera: 0,5x
EM-CCD: Andor iXon Ultra 888 (Ganho EM 300x), tempo de exposição: 120 segundos/foto, fixação: 1 × 1

Agradecimentos

Estas notas de aplicação foram preparadas com a ajuda dos seguintes pesquisadores:
Professor Kenji Nagai e Professor Assistente Mitsuru Hattori
Instituto de Pesquisa Científica e Ida Universidade de Osaka, Laboratório Nagai

As amostras de embrião de mosca da fruta foram preparadas com a ajuda dos seguintes pesquisadores:
Professor Toshie Kai e Professor Assistente Ritsuko Sugiyama
Escola de Pós-graduação de Ciências Biológicas Frontier da Universidade de Osaka, Laboratório de Biologia Reprodutiva

*O sistema de formação de imagem de luminescência usado nesses experimentos foi resultado de um desenvolvimento conjunto realizado pelo Professor Kenji Nagai et al. do Instituto de Ciências e Tecnologia da Universidade de Osaka, da Tokai Hit Co. Ltd. e da Olympus Corporation como parte de um programa de desenvolvimento de tecnologia/equipamento de medição e análise avançadas e combinando componentes de produtos existentes, incluindo o microscópio Olympus IXplore Live. Apesar de este sistema específico somente estar disponível em certas regiões, a Evident Life Sciences oferece soluções de luminescência semelhantes aos seus clientes globais. Entre em contato com o seu representante de vendas local da Evident para obter mais detalhes.

Trabalhos citados:
Biochem. Biophys. Rep., 23 (2020) 100771

†Observação: as células HeLa são uma das cepas de células mais conhecidas e importantes para a pesquisa médica e desenvolvimento científico. Elas contribuíram para grandes descobertas na área da imunologia, doenças infecciosas e pesquisa de câncer, e levantaram sérias dúvidas sobre a ética no campo médico. Acesse http://henriettalacksfoundation.org/ para obter mais informações sobre a vida de Henrietta Lacks e suas contribuições para a medicina moderna.