Distinguindo vasos sanguÌneos cerebrais e tumorais em tecidos profundos usando microscopia multifÛton

A microscopia convencional de excitação por dois fótons (2PE) usa geralmente luz laser na região NIR-I (700–950 nm) como fonte de luz de excitação, limitando a profundidade da formação de imagens a cerca de 500 µm. Quando comparada com a luz NIR-I, a luz NIR-II (1.000–1.700 nm) demonstra uma atenuação de luz mais reduzida em tecidos biológicos. A luz NIR-II consegue também penetrar mais profundamente para excitar os fluoróforos durante a formação de imagens de tecidos in vivo. Além disso, a autofluorescência induzida pela luz NIR-II é significativamente mais baixa que a da luz NIR-I, ajudando a melhorar a relação sinal/fundo das imagens 2PE.

O microscópio de excitação multifóton FVMPE-RS da Olympus está equipado com sistema laser pulsado IR InSight DS para permitir a formação de imagens multifotônicas com excitação entre 680–1.300 nm. Seguem-se duas aplicações de formação de imagens profundas in vivo que beneficiam do uso do microscópio de excitação multifóton com luz NIR-II.

1. Pontos de polímeros conjugados excitáveis por NIR-II para formação de imagens de dois fótons no cérebro in vivo em profundidade através de um crânio intato^[1]

A microscopia 2PE através de um crânio intato de camundongo é desafiadora devido à forte dispersão induzida pelo osso craniano. Para superar esse desafio, desenvolvemos pontos de polímeros conjugados (CPdots) de cadeia única e excitáveis por luz NIR-II com fluorescência brilhante na região NIR-I (pico a cerca de 725 nm e rendimento quântico de 20,6 ± 1,0%) para formação de imagens 2PE in vivo em profundidade de um cérebro intato de camundongo. Usando o FVMPE-RS da Olympus equipado com sistema laser sintonizável ultrarrápido, efetuamos a formação de imagens 2PE do cérebro de camundongo durante a excitação a 800, 1.040 e 1.200 nm. Esse sistema possibilita a sintonização livre do comprimento de onda sem trabalho de ajuste complicado. A excitação a 1.200 nm originou a maior profundidade na formação de imagens e a mais alta relação sinal/fundo. Além disso, foi obtida uma reconstrução 3D da rede de vasos sanguíneos do cérebro com uma grande profundidade vertical de 400 µm através do crânio intacto.

Figura 1. Imagens 2PE da vasculatura cerebral em um camundongo injetado com pontos de PC adquiridas na mesma coluna cortical (em uma profundidade de 300 µm) durante a excitação por laser fs a 800, 1.040 e 1.200 nm. A emissão foi coletada entre 660–750 nm. Cada quadro foi adquirido em 3,22 s. Todas as imagens apresentam a mesma barra de escala: 100 µm. Foram representados graficamente perfis de intensidade da linha 2PE ao longo dos vasos sanguíneos de cada quadro. Copyright 2019, Wiley-VCH.
 

Figura 2. Imagens 2PE reconstruídas em 3D dos vasos sanguíneos do cérebro através de um crânio intato. Excitação para geração de segundo harmônico (SHG, cor azul): 950 nm; excitação para 2PE: 1.200 nm. As emissões foram coletadas entre 455–500 nm para a SHG e entre 660–750 nm para os vasos sanguíneos. Cada quadro foi adquirido em 3,22 s. Copyright 2019, Wiley-VCH.
 

Vídeo 1. Imagem 2PE reconstruída em 3D dos vasos sanguíneos do cérebro marcados com CPdots. Excitação: 1.200 nm. Emissões: 660–750 nm. Copyright 2019, Wiley-VCH.

2. Microscopia intravital de excitação por dois fótons e NIR-II distingue vasculaturas cerebrais e tumorais profundas^[2]

A formação de imagens de fluorescência intravital da morfologia da vasculatura e das dinâmicas no cérebro e tumores com uma grande penetração em profundidade e alta relação sinal/fundo (SBR) é ideal para estudo e teragnóstico de cânceres e doenças relacionadas com vasos. Um fluoróforo altamente brilhante com emissão NIR induzida por agregação foi concebido para a microscopia intravital de excitação por 2PE e luz NIR-II em cérebros e tumores. Graças à profunda capacidade de penetração da luz NIR-II e ao alto brilho do fluoróforo, foi possível formar imagens das vasculaturas em tecidos profundos (cérebro e tumores).

Esquema 1. Ilustração esquemática da formação de imagens de fluorescência in vivo com dois fótons de um tumor sob excitação NIR-I e NIR-II. Copyright 2019, Wiley-VCH.
 

Figura 3. Imagem 2PE de vasos sanguíneos normais e de um tumor marcados com nosso fluoróforo. Os vasos sanguíneos tumorais mostram uma 2PE melhorada em comparação com vasos normais. Excitação: 1.200 nm; Emissões: 660–750 nm. Copyright 2019, Wiley-VCH.
 

Figura 4. Imagens 2PE reconstruídas em 3D das redes de vasculatura tumoral presentes no mesmo tumor sob excitação NIR-II (a) e NIR-I (b). Excitações: 1.200 nm para NIR-II e 920 nm para NIR-I. Barras de escala: 100 μm. Profundidade da formação de imagens (através da pele): 500 μm para excitação NIR-II e 300 μm para excitação NIR-I. Copyright 2019, Wiley-VCH.

Referências:

[1] NIR‐II Excitable Conjugated Polymer Dots with Bright NIR‐I Emission for Deep In Vivo Two‐Photon Brain Imaging Through Intact Skull
[2] NIR-II-Excited Intravital Two-Photon Microscopy Distinguishes Deep Cerebral and Tumor Vasculatures with Ultrabright NIR-I AIE Luminogen

Equipamento de aquisição de imagens

Microscópio: sistema FVMPE-RS
Objetiva: objetiva de imersão em água de 25X (XLPLN25XWMP2)

Comentários: Dr. Shaowei Wang

O microscópio multifóton FVMPE-RS da Olympus é uma ferramenta poderosa para a formação de imagens intravitais. O laser IV pulsado InSight DS com comprimentos de onda sintonizáveis entre 680–1.300 nm é útil em várias aplicações de formação de imagens de fluorescência in vivo com dois fótons. Graças ao revestimento óptico otimizado e à excelente objetiva com alta transmitância na região NIR-II, foi possível efetuar microscopia intravital de excitação por dois fótons e NIR-II com nossos fluoróforos ultrabrilhantes. A profundidade da formação de imagens e a relação sinal/fundo melhoraram sob a excitação NIR-II.

Agradecimentos

Esta nota de aplicação foi preparada com a ajuda do pesquisador:
Dr. Shaowei Wang, Departamento de Engenharia Química e Biomolecular, Universidade Nacional de Singapura (Principal)

Como o FVMPE-RS tornou nosso experimento mais fácil