Rastreamento de amostras fluorescentes muito espessas com o escâner de lâminas para pesquisa SLIDEVIEW VS200

Introdução

No Instituto Max Planck de Biologia Celular Molecular e Genética (MPI-CBG) em Dresden, Alemanha, os pesquisadores estão investigando as capacidades de regeneração do verme planário Schmidtea mediterranea usando o escâner de lâminas de pesquisa Olympus SLIDEVIEW VS200. S. mediterranea é um modelo popular para estudar a biologia da regeneração do sistema.

As vantagens de usar S. mediterranea incluem:

1. O baixo custo para preservar e manter uma quantidade suficiente de animais no laboratório
2. Um genoma recentemente sequenciado
3. Ferramentas e métodos estabelecidos para estudos de função de perda de gene via RNA de interferência (RNAi)

Compreendendo as capacidades de regeneração da Schmidtea Mediterranea

Os investigadores do MPI-CBG estão utilizando as qualidades extraordinárias da Schmidtea mediterranea. Mesmo quando cortada em pequenos pedaços, cada pedaço pode se regenerar em uma planária em miniatura perfeitamente completa e proporcionada. As células-tronco adultas desempenham um papel importante neste processo, pois uma única célula-tronco pode restaurar um verme completo.

Muitos pesquisadores hoje procuram entender mais claramente como a S. mediterranea se regenera. Um passo importante em direção a esse objetivo foi a primeira montagem do genoma altamente contíguo de S. mediterranea, relatada por pesquisadores do MPI-CBG em cooperação com o Instituto Heidelberg de Estudos Teóricos (HITS) em um artigo da revista Nature.*

A montagem revela um genoma que contém novos elementos de repetição gigantes e novos genes específicos de tênia. No entanto, ela carece de outros genes que eram considerados essenciais para manter um animal vivo. Esta descoberta tem implicações potenciais nos campos da pesquisa de regeneração, biologia de células-tronco e bioinformática.

Captura de imagens de fluorescência de alta resolução de Schmidtea Mediterranea

Para seus estudos, os pesquisadores do MPI-CBG usam os poderosos recursos dos sistemas de digitalização de lâminas. Eles usam o escâner de lâminas VS200 para adquirir imagens de fluorescência de alta resolução.

“O escâner VS200 da Olympus não só nos permite adquirir com facilidade imagens de alta resolução, mas também fornece TruSight Live, uma função de remoção de manchas em tempo real”, explicou o Dr. Tobias Boote do MPI-CBG.

Os espécimes preparados são bastante espessos, pois não são cortados antes de serem imobilizados em uma lâmina. Com essa amostra de 200–300 μm de espessura, as funcionalidades TruSight Live ou Z-stack do sistema são essenciais.

A opção TruSight Live permite que os pesquisadores reduzam a perturbação da luz difusa das áreas acima e abaixo do plano de foco. Os dados da imagem serão então calculados novamente com um algoritmo especial de deconvolução 2D. Isso torna as imagens mais nítidas e claras.

Para sua pesquisa, a S. mediterranea foi imobilizada em uma lâmina, corada com hibridização in situ dupla fluorescente (vermelho e verde) de dois marcadores de glândula de gema em indivíduos sexualmente maduros, e escaneada com aumento de 10X em um sistema de escaneamento de lâmina VS200. O contracorante nuclear com DAPI também foi adquirido. Os dois marcadores eram ferritina e surfactante b, que marcam gema em planários.

A imagem à esquerda abaixo mostra um rastreamento em que nenhum deblur online foi aplicado. Na imagem direita, o TruSight Live foi aplicado a todos os três canais (DAPI, FITC e CY3) durante o escaneamento.

S. mediterranea corada com hibridização in situ dupla fluorescente (vermelho e verde), contrastada com DAPI e escaneada com aumento de 10X. Esquerda: sem deblur online. Direita: com deblur online aplicado a todos os três canais (DAPI, FITC e CY3). A imagem da direita é mais clara do que a imagem da esquerda, pois o reflexo em torno de cada sinal é removido. Amostra fornecida por Miquel Vila-Farré, MPI-CBG.

“As imagens e dados que estamos adquirindo agora são uma fonte essencial para nossa investigação em andamento na compreensão da relação entre a abundância de tecido reprodutivo em planárias adultas e a capacidade de regenerar o animal. Para isso, preciso de múltiplos marcadores, como os genes surfactante B e ferritina, conforme mostrado na foto”, disse o Dr. Miquel Vila-Farré da MPI-CBG.

Como alternativa ao TruSight Live, você também pode adquirir um Z-stack virtual contendo no máximo 31 planos, conforme mostrado nas imagens abaixo.

S. mediterranea corada com hibridização in situ dupla fluorescente (vermelho e verde) e escaneada com aumento de 10X. Esquerda: Z-stack virtual contendo 31 planos. Direita: imagem com um plano. Amostra fornecida por Miquel Vila-Farré, MPI-CBG.

Após a aquisição da imagem, você pode focar perfeitamente através da Z-stack para ver a distribuição do sinal através da espessura da amostra.

No exemplo de imagem a seguir, você vê uma hibridização dupla fluorescente in situ de dois marcadores do sistema excretor na planária Schmidtea mediterranea, Smed-cubilin-1 (FITC, verde) e um novo gene (dd_2920, vermelho CY3). DAPI (azul) foi usado para coloração nuclear. “Para comparar a organização estrutural do sistema excretor planariano com a do néfron vertebrado, usamos Smed-cubilin-1 e dd_2920 como marcadores para visualizar dois tipos diferentes de células do sistema excretor planariano, célula tubular proximal e célula de filtração, respectivamente,” comentou o Dr. Hanh Vu da MPI-CBG.

Hibridização in situ dupla fluorescente (vermelha e verde) de dois marcadores do sistema excretor na planária S. mediterranea.

Conclusão

O escâner de lâminas de pesquisa Olympus VS200 captura imagens de fluorescência de alta resolução de amostras muito espessas, como Schmidtea Mediterranea. Sua funcionalidade TruSight Live e Z-stack são recursos essenciais que ajudam os pesquisadores a observar e analisar os detalhes finos nessas amostras espessas.

Agradecimentos
Esta nota de aplicação foi preparada com a ajuda de pesquisadores do Instituto Max Planck de Biologia Celular e Molecular e Genética, Dresden, Sachsen, Alemanha e Dr. Daniel Göttel, especialista em aplicações, Olympus Soft Imaging Solutions em Münster, Alemanha:

• Tobias Boote, possui um pós-doutorado pelo Instituto Max Planck de Biologia Celular e Molecular e Genética, Dresden, Sachsen, Alemanha
• Miquel Vila-Farré, Pesquisador de Pós-Doutorado no Instituto Max Planck de Biologia Celular e Molecular e Genética, Dresden, Sachsen, Alemanha
• Hanh Vu, pesquisador de pós-doutorado no Instituto Max Planck de Biologia Celular e Molecular e Genética, Dresden, Sachsen, Alemanha
• Daniel Göttel, especialista em aplicações, Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster, Alemanha

Referências
24 de janeiro de 2018 (DOI: 10.1038/nature25473).