Automatização do processo de triagem de medicamento: da preparação de esferoides tumorais à análise de imagem 3D

Resumo

Uma solução que combina a seleção automatizada de célula e o sistema de formação de imagem do CELL HANDLER™ da Yamaha com nosso microscópio confocal de varredura FLUOVIEW™ FV3000 e o software NoviSight™ para possibilitar a automação de quase todo o processo de trabalho de triagem de medicamentos contra esferoides tumorais (Figura 1). Isso inclui todas as operações desde a fase de preparação da amostra até a análise da imagem 3D. Um processo de trabalho automatizado possibilita a realização de ensaios com muitos modelos de célula 3D de uma maneira estável e eficiente.

Figura 1. Processo de trabalho automatizado de triagem de medicamentos contra esferoides tumorais

Introdução

Avaliar o desempenho de um medicamento com o uso de esferoides tumorais é importante, pois os esferoides refletem o microambiente complicado in vivo do câncer com muito mais precisão do que modelos bidimensionais. Isso permite que os pesquisadores avaliem a eficácia de um medicamento sob condições que mais se assemelham ao ambiente natural de um tumor.

No entanto, a preparação, a coloração, a formação de imagem e a análise 3D de várias amostras são extremamente demoradas. Para simplificar esse fluxo de trabalho, automatizamos a preparação, a fixação e a coloração com o Yamaha CELL HANDLER™ e a aquisição de imagem e análise 3D com o sistema FV3000 e o software NoviSight™.

Vantagens

• O CELL HANDLER permite a preparação da amostra sem danos às células nem perda de amostras. Além disso, as imagens dos esferoides são capturadas antes e depois da transferência da amostra, e vários parâmetros são analisados para ajudar a garantir a total rastreabilidade.
• O microscópio confocal de varredura a laser FV3000 e o software NoviSight podem realizar facilmente a análise tridimensional de várias amostras. É possível quantificar as diferenças nos efeitos dos medicamentos dentro e fora do esferoide.

Métodos

Preparação da amostra de esferoide tumoral

Primeiro, são criados esferoides com diâmetro de 100 µm em uma placa com fundo em U ultrabaixa e tratada com 2 nM de Paclitaxel (PTX) ou DMSO. Após uma cultura de 3 dias, os esferoides foram corados com o kit de formação de imagem de viabilidade celular ReadyProbe™ (verde/azul) e transferidos para uma placa com solução de fixação e tratados de um dia para o outro a 4 ℃. Depois, as células foram transferidas para o SCALEVIEW-S4 e tratadas de um dia para o outro a 37 °C. Todas as transferências de amostra foram realizadas com um Yamaha CELL HANDLER.

Formação de imagens de esferoides em placas de poço e análise de imagens 3D

O microscópio a laser de escaneamento confocal FV3000 foi usado para adquirir várias imagens fluorescentes dos esferoides em placas. Os dados de imagem foram importados no software de análise celular 3D NoviSight, que reconheceu células vivas e mortas nas imagens 3D e depois calculou precisamente as taxas de viabilidade em cada poço.

Resultados

Formação de imagens e análise no Yamaha CELL HANDLER™

O CELL HANDLER pode adquirir imagens e dados de morfologia antes e depois da transferência da amostra. As imagens mostraram que a maioria dos esferoides foram transferidos com sucesso sem perda de amostra (Figura 2).

Figura 2. Esferoides durante a coloração e fixação

Nenhuma diferença na área foi observada entre os esferoides tratados ou não com PTX. Por outro lado, os sinais fluorescentes mostraram que o PTX reduziu significativamente o número de células vivas no HT-29, enquanto nenhuma redução ocorreu nos esferoides HCT-15 (Figura 3).

Figura 3. Área de esferoides e viabilidade celular, N=6, **: p < 0,01, barras de erro: SE

Aquisição de imagem e análise 3D com o sistema FV3000 CLSM e software NoviSight

Para analisar o efeito do PTX no microambiente do esferoide, os esferoides foram observados com o microscópio FV3000 (Figura 4).

Figura 4. Imagens adquiridas com o microscópio FV3000, azul: núcleo (todas as células), vermelho: núcleo (célula morta)

Várias imagens 3D foram carregadas no software NoviSight para análise 3D, que mostrou grande redução no número de células viáveis nos esferoides HT-29 e grande efeito nos esferoide do centro para dentro devido ao PTX. Por outro lado, um efeito menor foi observado nos esferoides HCT-15 (Figura 5).

Figura 5. Viabilidade celular por análise de imagem 3D, N=3~6, **: p < 0,01, barras de erro: SE

Conclusão

O Yamaha CELL HANDLER simplifica a preparação de grande número de amostras de esferoide. As amostras podem ser analisadas facilmente em três dimensões usando o microscópio FV3000 e o software NoviSight. A precisão das análises celulares 3D pode ser melhorada por meio da alta rastreabilidade oferecida por esse processo de trabalho automatizado.

Autor

Hiroya Ishihara, Engenharia biológica, Pesquisa e desenvolvimento, EVIDENT