Automação da formação de imagem e da quantificação de ensaios de migração usando um sistema de monitoramento de incubação

Delineamento experimental

As informações de migração celular podem ser valiosas em muitas áreas de pesquisa, tais como a cicatrização de feridas e câncer. No campo da cicatrização de feridas, elas são usadas para avaliar medicamentos que promovem a migração celular para fechar feridas. No campo do câncer, elas são usadas para avaliar medicamentos que inibem a metástase e a infiltração das células cancerígenas. Uma forma de medir isso é por meio de um ensaio de migração, no qual as células aderentes em uma placa de cultura de tecido são observadas ao migrar para uma lacuna sem células. A parte mais importante e desafiadora da execução de um ensaio de migração é a determinação das durações de migração apropriadas. Um ensaio de migração analisado muito cedo não consegue mostrar as diferenças entre as condições, ao passo que um ensaio analisado muito tarde resulta no preenchimento total de áreas abertas com células em ambas as condições de teste e controle. Antes, o pesquisador precisava formar a imagem do ensaio de migração manualmente no ponto de tempo correto para obter os dados necessários para a quantificação e depois aplicar manualmente seu método de quantificação.

Aqui, reportamos a análise dos efeitos inibitórios da migração celular do medicamento anticâncer sorafenibe na linha celular de câncer de mama humano MCF7. Também demonstramos como a formação de imagem e a quantificação dos ensaios de migração podem ser automatizadas usando o sistema de monitoramento de incubação Olympus Provi™ CM20.

Procedimentos experimentais

As células MCF7 foram cultivadas em um meio RPMI-1640 suplementado com soro fetal bovino (SFB) a 10% e solução de penicilina/estreptomicina a 1%. As células foram semeadas em um placa de 24 poços usando um Ibidi Culture-Insert 2 Well (ibidi, Nº de ref. ib80209) a uma densidade de 105.000 células/70 μL/câmara. O Ibidi Culture-Insert 2 Well foi removido 24 horas após a semeadura, criando uma lacuna para a migração celular. As células foram lavadas três vezes e tratadas com sorafenibe (10 ou 30 μM) ou foram mantidas como controles sem tratamento. O monitor do CM20 automaticamente formou imagens das células a cada hora por até 94 horas para quantificar a confluência da avaliação da migração celular.

Resultados

Figura 1. Imagens das células durante o ensaio de migração.

Superior: controle, centro: 10 μM de sorafenibe, inferior: 30 μM de sorafenibe. As áreas mascaradas indicam as áreas confluentes detectadas automaticamente pelo monitor CM20.

A migração celular foi reduzida em ambos os grupos tratados com sorafenibe proporcionalmente à concentração de sorafenibe e ainda estava aberta às 48 horas, enquanto o controle já havia fechado nesse ponto de tempo.

Figura 2. Quantificação da confluência em um ensaio de migração.

Superior: controle, centro: 10 μM de sorafenibe, inferior: 30 μM de sorafenibe.

A quantificação da confluência com o monitor CM20 mostrou concordância com os resultados das observações celulares. As células de controle apresentaram quase 100% de confluência às 48 horas, ao passo que as células tratadas com sorafenibe mostraram uma menor confluência proporcional à concentração de sorafenibe.

Figura 3. Quantificação do fechamento em relação ao controle às 48 horas.

Barra = média ± SE, n=3

Tabela 1. Quantificação da migração celular em um ensaio de migração.

A migração celular foi determinada subtraindo os níveis de confluência no início do tratamento dos níveis após tratamentos de 48 horas. Constatou-se que a migração celular foi significativamente inibida proporcionalmente às concentrações de sorafenibe.

Benefícios das avaliações usando o sistema de monitoramento de incubação

Conseguimos detectar de maneira eficaz os efeitos inibitórios da migração celular do medicamento anticâncer em um ensaio de migração usando o sistema de monitoramento de incubação CM20.

Configurar o tempo de medição apropriado é essencial em um ensaio de migração. Os efeitos dos medicamentos podem ser melhor detectados quando avaliados no momento da migração completa para a condição mais rápida (ou seja, o grupo de controle nesta análise). Antes, era necessário observar as células em intervalos de algumas horas para verificar a migração e, portanto, planejar os experimentos de acordo com a disponibilidade do pesquisador. Mesmo assim, havia o risco de ocorrer uma migração completa durante a noite. O monitor CM20 resolve esse problema formando imagens e quantificando a migração celular automaticamente ao longo do tempo. Assim, o sistema permite que o usuário analise as células de acordo com a sua conveniência, melhorando bastante a eficiência do processo de trabalho. Usar um sistema de monitoramento de incubação em experimentos de migração tem o potencial de poupar tempo dos pesquisadores, melhorar a precisão e a consistência e levar a ensaios mais bem-sucedidos.

Agradecimentos

Esta nota de aplicação foi preparada com a ajuda do seguinte pesquisador:

Takahiro Yamaguchi, PhD, Pesquisador Principal da ACEL, Inc.