Determinação da proliferação e da citotoxicidade celular com maior precisão e facilidade usando o sistema de monitoramento de incubação CM20

Introdução

O ensaio de proliferação/citotoxicidade celular é um dos testes mais usados em pesquisas envolvendo células em cultura. Trata-se de um teste preliminar essencial para o exame das concentrações de fármacos a serem usados nos tratamentos e serve como um teste muito importante para determinar a eficácia e a segurança dos fármacos em vários campos de pesquisa, como oncologia e morte celular.

Convencionalmente, o ensaio de WST-8 ou de ATP, que usa atividade metabólica como índice, e o ensaio de BrdU ou de timidina, que utiliza o nível de síntese de DNA como índice, têm sido usados para a avaliação quantitativa das caraterísticas de crescimento das células. Embora esses ensaios sejam benéficos devido à sua simplicidade e produtividade, eles são todos métodos de avaliação indireta e, consequentemente, os resultados podem não estar correlacionados com o número real de células. Eles são, em muitos casos, avaliações do endpoint, que às vezes resultaram na falha em capturar alterações temporais, fazendo com que descobertas importantes sejam ignoradas.

Devido a essas limitações, consideramos que o desenvolvimento de um método para avaliações diretas e temporais da proliferação/citotoxicidade celular é importante para os campos de pesquisa que empregam células em cultura.

Delineamento experimental

Para verificar a capacidade do sistema de monitoramento de incubação OLYMPUS Provi CM20 para avaliação de proliferação/toxicidade celular, realizamos os dois ensaios a seguir para comparar o sistema CM20 com um ensaio convencional (WST-8):

• Ensaio de morte celular com fármaco anticancerígeno (5-FU) em células A549 de adenocarcinoma pulmonar humano
• Ensaio de morte celular com neurotoxina (6-OHDA) em células SH-SY5Y de neuroblastoma humano

Procedimentos experimentais

Ensaio de morte de células cancerosas com fármaco anticancerígeno (5-FU)

As células A549 de adenocarcinoma pulmonar humano foram semeadas em uma placa de múltiplos poços, tratadas com 5-FU (400 μM) por 72 horas a partir do ponto de tempo de 24 horas após a semeadura, com imagens e contagem do número de células a cada hora pelo sistema CM20. A concentração de 5-FU para o tratamento foi definida de modo que a proliferação celular e a morte celular estivessem em equilíbrio, com um grupo não tratado com 5-FU definido como controle. Os métodos convencionais foram usados para medir a viabilidade celular em 0, 24, 48 e 72 horas após o início do tratamento, usando o ensaio de WST-8.

Ensaio de morte celular com neurotoxina (6-OHDA)

As células SH-SY5Y de neuroblastoma humano foram semeadas em uma placa de múltiplos poços, tratadas com 6-OHDA (60 μM) por 24 horas a partir do ponto de tempo de 24 horas após a semeadura, com imagens e contagem do número de células a cada hora pelo sistema CM20. A concentração de 6-OHDA para o tratamento foi definida para induzir morte celular rápida, com um grupo não tratado com 6-OHDA definido como controle. O método convencional mediu a viabilidade celular em 0, 6, 12 e 24 horas após o início do tratamento usando o ensaio de WST-8.

Resultados

Ensaio de morte de células cancerosas com um fármaco anticancerígeno (5-FU) e células A549

Figura 1. Imagens de células A549 após tratamentos com 5-FU.
Linha superior: Grupo não tratado com 5-FU. Linha inferior: Grupo tratado com 400 μM de 5-FU.

No grupo não tratado com 5-FU, o número de células aumentou com a duração da cultura e observou-se que as células se tornaram 100% confluentes perto das 72 horas de tratamento. No grupo tratado com 5-FU, o número de células mortas aumentou com a duração do tratamento sem alteração significativa da densidade celular após o tratamento de 24 horas.

Figura 2. Determinação quantitativa da viabilidade das células A549.
Esquerda: o número de células determinado pelo CM20. Direita: o número de células determinado usando o método de ensaio convencional (WST-8).

A análise com o sistema CM20 mostrou que o número de células aumentou em uma curva sigmoide no grupo não tratado com 5-FU, enquanto o número de células não mudou significativamente após 24 horas do tratamento no grupo tratado com 5-FU, indicando que a proliferação celular e a morte celular estavam em equilíbrio. Esses resultados são consistentes com a observação visual das células. Eles também estão de acordo com os resultados obtidos pelo método convencional (ensaio de WST-8).

Ensaio de morte de células cancerosas com neurotoxina (6-OHDA) e células SH-SY5Y

Figura 3. Imagens de células SH-SY5Y após tratamentos com 6-OHDA.
Linha superior: Grupo não tratado com 6-OHDA. Linha inferior: Grupo tratado com 60 μM de 6-OHDA.

No grupo não tratado com 6-OHDA, observou-se um ligeiro aumento do número de células no ponto de 24 horas. No grupo tratado com 6-OHDA, observou-se uma diminuição do número de células no estágio de tratamento de 6 horas e, no tratamento de 12 horas, observou-se que a maioria das células estava morta.

Figura 4. Determinação quantitativa da viabilidade das células SH-SY5Y.
Esquerda: o número de células determinado pelo sistema CM20. Direita: o número de células determinado usando o método de ensaio convencional (WST-8).

A análise usando o sistema CM20 mostrou que o número de células aumentou ligeiramente em 24 horas no grupo não tratado com 6-OHDA, enquanto no grupo tratado com 6-OHDA, o número de células começou a diminuir no tratamento de 3 horas e continuou a diminuir depois disso. O número de células não apresentou alteração significativa após o tratamento de 12 horas, indicando que quase todas as células morreram em cerca de 12 horas após o tratamento. Esses resultados são consistentes com a observação visual das células. Eles também estão de acordo com os resultados usando o método convencional (ensaio de WST-8).

Discussão sobre os resultados obtidos pelo sistema CM20 versus o ensaio convencional

A análise usando o sistema de monitoramento CM20 da ação do fármaco anticancerígeno em células cancerosas e da neurotoxicidade de outro fármaco em células do sistema nervoso forneceu quase os mesmos resultados que os obtidos com a observação de imagens e um método convencional (ensaio de WST-8).

Benefícios das avaliações usando o sistema de monitoramento de incubação CM20

Um dos benefícios de usar o sistema CM20 para a avaliação é que o curto intervalo de amostragem permite que os usuários verifiquem os detalhes das alterações temporais. Por exemplo, o teste usando células SH-SY5Y mostra que quase todas as células morreram aproximadamente 12 horas após o tratamento com 6-OHDA. Enquanto que os ensaios de endpoint não fornecem essas informações.

Outro benefício do sistema CM20 é que os dados de curso do tempo podem ser obtidos em apenas uma placa. O método convencional requer a preparação de uma placa para cada ponto de tempo de medição, o que aumenta a quantidade de trabalho pelo número de pontos de tempo e limita o número de placas que podem ser analisadas. Além disso, um aumento dos pontos de medição ao usar um método de ensaio convencional também aumenta a complexidade da análise de dados, enquanto o sistema CM20 permite a observação automática de múltiplos pontos e a saída automática de gráficos dos resultados.

Um benefício adicional do sistema CM20 vem de seu recurso de aquisição automática de imagens que permite aos usuários analisar o estado da proliferação celular e as alterações morfológicas mesmo após o início do estágio de análise de dados. O sistema CM20 registra as imagens das células durante toda a análise para que mais informações potencialmente cruciais possam ser coletadas e analisadas. Mesmo nos casos em que o método convencional requer uma estimativa da duração apropriada para os tratamentos, analisando vários pontos seguidos de novos testes, a análise usando o sistema CM20 permite que os usuários determinem a duração apropriada para os tratamentos posteriormente em um único teste e extraiam os dados dentro dessa duração.

Comentários do Dr. Yamaguchi

Em primeiro lugar, fiquei impressionado com a precisão da contagem de células ao usar o sistema de monitoramento de incubação CM20. As células reconhecidas pelo sistema CM20 foram exibidas separadamente em um monitor, uma por uma. Confirmei que este ensaio permite avaliações quantitativas altamente reproduzíveis quando os parâmetros iniciais são definidos corretamente.

Ao contrário do método convencional de medição indireta do número de células, o sistema CM20 não requer qualquer rotulagem. Como a marcação pode impactar as células, evitar esse procedimento torna o sistema CM20 um método de ensaio confiável para a avaliação do número de células. Além disso, o atrativo do sistema CM20 é que ele permite a aquisição quase automática de dados por muitos pontos de tempo em uma única placa, o que reduz muito a quantidade de trabalho e ajuda a eliminar o risco de ignorar dados importantes.

Dependendo dos tipos e concentrações dos fármacos usados nos experimentos, algumas variações podem ser observadas no meio dos tratamentos, mesmo no caso de, por exemplo, nenhuma diferença ser observada no endpoint onde as células estão todas mortas ou atingiram a confluência. Acho que o uso do sistema CM20 pode reduzir consideravelmente o tempo e o esforço necessários para estimar a duração do tratamento nesses casos, o que pode melhorar a eficiência e a velocidade da pesquisa.

Agradecimentos

Esta nota de aplicação foi preparada com a ajuda do pesquisador:
Takahiro Yamaguchi, PhD, Pesquisador Principal da ACEL, Inc.