배양 모니터링 시스템을 사용한 다지점 관찰 검증

서론

배양 조건을 적절하게 유지하고 제어하려면 일상적인 세포 배양 프로세스를 진행하는 동안 작업자는 많은 시간과 노력이 필요합니다. 기존의 세포 배양 워크플로에 따라 세포를 적절하게 관리하려면 작업자는 인큐베이터에서 세포를 제거하고 시간 경과에 따라 현미경으로 세포 수와 포화도를 관찰 및 계산하여 조건을 확인해야 합니다.

또한, 실험의 일관성과 재현성을 향상하려면 준비 단계 동안 일정한 수준으로 세포의 질을 유지해야 합니다. 그러나 작업자의 숙련도와 기타 요인 때문에 작업 중 질적 차이가 발생할 수 있습니다. 세포 배양은 생명 과학 및 의학 연구의 출발점이므로 세포의 질은 후속 실험에 큰 영향을 줍니다. 따라서 특정 배양 조건에 따라 세포의 질을 적절하게 유지하고 관리해야 합니다.

Evident의 CM30 배양 모니터링 시스템은 1년 365일 24시간 인큐베이터 내부의 세포 배양 조건을 원격으로 자동 모니터링하여 이러한 프로세스를 간소화합니다. 또한 AI 기반 분석 결과를 바탕으로 세포 상태를 정기적으로 시각화합니다. CM30 시스템의 지속적이고 표준화된 측정을 통해 작업자는 직관에 의존하지 않고 세포 상태를 재현 가능한 방식으로 효율적으로 정량화할 수 있습니다.
 

다지점 관찰을 통해 전체 용기의 세포 상태 추정

세포의 질을 유지하려면 작업자가 세포 조건을 매일 관찰하고 적절하게 관리해야 합니다. 과거에 작업자들은 현미경으로 전체 용기를 관찰하여 세포 상태와 계대 및 수집에 적절한 시기를 이해하기 위해 많은 시간과 노력을 들여야 했습니다. 이 경우, 세포의 분주 상태가 취급되는 세포 유형, 용기, 작업 방법에 따라 고르지 않을 수 있으므로 어느 정도 숙련된 작업자조차 용기 내의 관찰 필드와 전체 배양 용기를 확인해야 합니다.

이러한 이유로, CM30 시스템은 하루에 한 번 전체 용기를 자동으로 이미징한 다음, 지정된 관찰 지점을 반복적으로 이미징합니다. 따라서 카메라는 전체 배양 용기에서 정보를 주기적으로 획득함과 동시에 원하는 관찰 지점을 계속 이미징할 수 있습니다.

그러나, 배양 프로세스의 각 시점마다 전체 용기에서 정보를 수집하면 하드웨어와 소프트웨어 측면에서 다양한 위험이 초래됩니다. 예를 들어, 많은 획득 시간과 데이터의 양 때문에 데이터 취급이 복잡해질 수 있습니다. 또한, 모니터링 시스템을 오랫동안 작동하게 되므로 인큐베이터 내부 온도가 상승하므로 이러한 환경적 변화가 세포에 주는 영향을 고려해야 합니다.

CM30 시스템은 데이터 신뢰성을 달성하는 동시에 이러한 위험을 방지하기 위해 용기 크기에 따라 정의된 여러 시점에서 세포 수를 세고(그림 1), 분석 결과의 평균으로 전체 용기의 배양 상태를 판단합니다. 이를 통해 CM30 시스템은 실제 배양 조건에서 거의 오류 없이 정량적 데이터를 효율적으로 확보합니다.

이 보고서에서는 다지점에서 전체 용기의 세포 상태를 판단하는 작업의 유효성을 확인하기 위해 CM30 시스템으로 정량적 데이터 획득, 비교, 검증*을 수행한 결과를 보여 줍니다.

*이 보고서는 Evident의 내부 검증 결과를 나타냅니다.

그림 1. 여러 세포 배양 용기의 다지점 관찰 지점 수.
 

세포 수 계산에 대한 비교 검증

세포 수에 대한 분석 결과를 비교하고 검증하기 위해 다음 세포 유형과 배양 용기가 사용되었습니다.

세포 유형, 배양 용기(다지점 관찰 지점의 수)

• A549, 12웰 플레이트(웰당 9개 지점)
• NHEK, T75 플라스크(25개 지점)

구체적으로, 동일한 분석 매개변수가 전체 용기와 동일한 시점에 CM30 시스템의 각 용기에 대해 정의된 여러 관찰 지점 각각에 적용되었으며, 세포 수 결과를 비교했습니다. 전체 세포 증식 프로세스에 걸쳐 결과를 비교하기 위해 세 가지 세포 밀도(낮음, 중간, 높음) 각각에 대한 결과도 검증했습니다.

CM30 시스템의 다지점 관찰의 유효성은 각 용기에 대해 정의된 여러 지점에서 분석된 세포 수 평균으로 계산한 전체 용기의 세포수와 위의 세 가지 세포 밀도의 실제 값으로서 전체 용기를 관찰하여 계산한 세포 수를 비교하여 검증했습니다.

하나의 관찰 지점에서만 전체 용기에 대한 계산을 수행했을 때 세포 수의 변화 정도를 확인하기 위해, 위의 전체 관찰을 통해 얻은 하나의 관찰 지점에서 최대 및 최소 세포 수로 계산한 전체 용기의 세포 수와 전체 용기의 실제 세포 수(실제 값)를 비교했습니다.
 

배양 모니터링 시스템을 사용한 다지점 관찰의 유의미성

아래의 그림 2는 12웰 플레이트 및 T75 플라스크에 대해 전체 용기에서 계산한 세포 수(실제 값)과 다지점 관찰을 통해 계산한 세포 수를 보여줍니다.

그림 2. 전체 용기 및 다지점 관찰 간에 계산된 세포 수 오차.

일반적으로, 실제 값의 ±10%의 정확도로 세포 수 및 포화도 분석이 품질 검사를 위해 세포 준비 과정에서 수행되었습니다. 이 유효성 검증에서 12웰 플레이트와 T75 플라스크 모두 전체 용기 및 다지점 관찰 기반 계산 간 오차는 전체 증식 과정에서 ±2% 이내였습니다.

그러므로, 각 용기의 다지점 관찰을 통해 계산한 수치는 충분히 신뢰할 만한 데이터를 제공했으며, 전체 용기를 관찰할 필요가 없었습니다. 용기 영역당 관찰 지점 수가 적은 12웰 플레이트와 같은 심각한 조건에서도 전체 용기의 계산 수치 오차는 전체 증식 과정에서 ±2% 이내였습니다. 따라서, CM30 시스템의 다지점 수는 전체 용기의 세포 상태를 판단하기에 충분한 것으로 간주되었습니다.

다지점 관찰의 유효성 검사뿐만 아니라, 용기의 한 관찰 지점에서만 세포 수를 계수하고 결과를 기반으로 전체 용기의 세포 상태를 판단할 때 동일한 방법을 점검했습니다(그림 2). 그 결과, 12웰 플레이트에서는 최대 60%의 계수 오류, 그리고 T75 플라스크에서는 최대 129%의 계수 오류가 발생한 것을 확인할 수 있었습니다.

이 결과가 고르지 못한 세포 분주 때문인지 확인하기 위해, T75 플라스크의 용기들에서 세포 수 변화의 정도를 보여주는 히트맵을 사용했습니다(그림 3). 노란색은 전체 평균 세포 수보다 세포가 25% 이상 더 많은 세포 영역을 나타내고, 하늘색은 세포가 25% 미만인 영역을 나타냅니다. 빨간색 선은 CM30 다지점 관찰 영역(T75 플라스크)을 나타내고, 주황색은 대부분의 세포가 감지된 영역을 나타냅니다. 그리고 파란색은 세포가 가장 적게 감지된 영역을 나타냅니다.

이러한 검증 결과는 세포 배양을 일상적으로 수행하는 어느 정도 숙련된 작업자라도 부분적으로 이러한 종류의 분주 변화를 경험할 수 있음을 보여줍니다. 또한, 이러한 결과는 하나의 관찰 지점을 전체 용기의 평균 세포 수에서 벗어난 영역으로 덮을 경우 전체적인 계산 위험이 매우 높아진다는 것을 보여줍니다.

그림 3. T75 플라스크의 세포 수 변화 정도를 보여주는 히트맵.

위에서와 같이 분주 불규칙성이 특정 비율로 발생하면, 단일 관찰 지점에서 전체 용기의 세포 상태를 판단할 때 작업자의 세포 배양 작업에 주요 문제가 없어도 실제 세포 수와 상당히 다른 결과를 얻을 위험이 높아집니다. 이는 높은 재현성을 가진 단일 관찰 지점에서 정량적 데이터를 얻기 어렵다는 것을 보여줍니다. 예를 들어, 단일 관찰 지점으로 제한된 모니터링 장치를 사용하는 경우, 전체 용기의 세포 상태를 정량화하기 위해 매번 용기 위치를 이동하여 여러 지점을 관찰해야 합니다.
 

결론

CM30 시스템에 대한 비교 검증에 따르면 전체 용기를 관찰하지 않고도 여러 지점에서 얻은 세포 수 평균을 통해 전체 용기의 실제 세포 수에 가까운 정량적 데이터를 얻을 수 있는 것으로 나타났습니다. 이는 여러 지점에서 전체 용기를 평가하는 작업의 유효성을 입증해 줍니다. 또한, 작업자가 어느 정도 숙련된 경우에도 어느 정도의 분주 불규칙성이 발생할 수 있다는 것을 고려할 때, 단일 관찰 지점에서 전체 용기의 세포 수를 계산하면 실제 세포 수와 상당히 다른 데이터를 얻을 위험이 높아집니다.

이 연구의 결과는 CM30 시스템에서 다지점 관찰을 통해 얻은 정량적 데이터가 세포 품질 관리 목적으로 신뢰할 수 있다는 점을 시사합니다. 또한, 단순히 세포 상태를 확인하는 경우에도 어느 정도의 분주 불규칙성을 고려하고 다지점 관찰을 수행하는 것이 중요함을 시사합니다.

CM30 시스템은 위의 분석 방법을 제공할 뿐만 아니라 세포 수, 포화도 및 기타 분석 기능을 개선하도록 업데이트되었습니다. 각 분석 매개변수에 대한 더 상세한 설정이 추가되어 AI 기반 분석의 정확성 역시 향상되었습니다. CM30 시스템은 사람 간 편차를 최소화하면서 배양 조건을 정량적으로 모니터링하여 효율성과 재현성 향상에 중점을 두므로 일상적 작업량이 많은 세포 배양 프로세스를 위한 최적의 솔루션입니다.
 

작성자

Masatoshi Dehari
글로벌 마케팅 생명과학 연구 솔루션 부문
Evident