FLUOVIEW FV4000 레이저 컨포컬 현미경을 위한 차세대 SilVIR 검출기 시스템 새로운 내용

요약

Evident는 FV4000 레이저 컨포컬 현미경을 위한 독자적인 차세대 SilVIR 검출기 시스템을 개척해 왔습니다. 이 검출기는 탁월한 신호 대 잡음비(S/N)로 매우 낮은 수준의 잡음과 높은 감도를 구현하며 가시광선부터 근적외선 파장까지 다색 이미징 분야에서 새로운 벤치마크가 되었습니다. SilVIR 감지기는 고속 및 하이 다이내믹 레인지 광자 계수 등 정확한 광자 감지 기능으로 실험 반복성을 지원합니다. 또한 PMT 감지기에서 일반적으로 요구되는 게인 조정이 필요하지 않으므로 간소화된 운영 경험을 제공합니다. SilVIR 감지기는 탁월한 성능 덕분에 레이저 스캐닝 현미경 분야에서 새로운 업계 표준을 정립하는 길을 걸어가고 있습니다.
 

1. 서문

높은 감도와 높은 게인으로 몇 광자 수준의 약한 빛도 감지할 수 있는 광전자 증배관(photomultiplier tube, PMT)은 매우 약한 형광을 포착하는 레이저 스캐닝 현미경(laser scanning microscopy, LSM)을 위한 표준 감지기입니다. 그러나, PMT를 사용하는 LSM과 관련된 여러 가지 문제가 있습니다. 이 문제에 대해서는 다음 섹션에서 논의하겠습니다.

SilVIR 감지기 시스템은 반도체형 센서를 사용하여 형광을 감지합니다. 이 실리콘 광전자 증배관(silicon photomultiplier, SiPM)은 기존 PMT의 문제와 제약 사항 중 다수를 해결합니다. 또한 신호 처리 회로는 센서의 기능을 극대화하는 기술을 통합하여 높은 픽셀수 및 고속 이미징의 응용 가능성의 넓힙니다(그림 1).

이 문서에서는 PMT 감지기를 사용하는 기존 LSM을 둘러싼 문제들과 SilVIR 감지기가 이러한 문제를 어떻게 해결하는지 설명합니다.

_{그림 1. SilVIR 검출기 구성 장치: (a) FV4000 형광 감지기 (b) SilVIR 감지기의 스펙트럼 감도를 보여주는 그래프 - 이 감지기는 광대역 타입 및 적색 강화 타입을 사용하여 기존의 고감도 GaAsP-PMT보다 높은 400nm~900nm의 감도를 구현함 (c) SilVIR 감지기는 SiPM 센서, 1GHz A/D 샘플링 및 디지털 신호 처리로 구성됨}
 

2. 레이저 스캐닝 현미경 검사자의 요구 사항 - 더 나은 감지기 제작 

LSM 사용자의 흔한 불만:

• 장치 성능을 극대화하기 위해 어느 설정을 사용할지 잘 모르겠음
• 과도한 광표백 및 광독성
• 의도하지 않은 감지기의 포화
• 이미지 품질, 해상도, 프레임 속도 개선 필요
• 더 나은 이미지를 획득할 수 없음

이러한 불만 사항의 근본 원인은 PMT 검출기 및 검출기의 주요 작동 원리입니다. Evident가 보다　진화한 검출기를 구현할 때 고려한 요인들은 다음과 같습니다.

높은 감도 및 신호 대 잡음비(S/N)

약한 형광 신호로 이미징을 수행할 때와 마찬가지로 소량의 입사 광자를 효율적으로 검출하려면 검출기의 양자 효율(QE)과 광자 검출 효율(PDE)이 높아야 합니다. 또한, 높은 S/N을 달성하려면 센서와 감지기 회로의 내재적 잡음이 무시할 만한 수준이어야 합니다.

감지된 빛 정량화

감지된 빛의 물리적 측정에 대한 정의는 다양하지만, “광자 수”의 정량화가 매우 약한 형광을 정량화하는 가장 정확한 방법입니다. 따라서, 강도를 측정하는 가장 간단한 방법은 감지된 광자 수를 측정하는 것입니다(그림 2).

형광 강도를 수치로 정량화하는 것은 매우 중요합니다. 예를 들면, 이럴 경우 장치별로 값이 달라지지 않으므로 여러 기기에서 동일한 이미징 결과를 재현할 수 있습니다. 이와 더불어, 광자 수 값은 보편적이므로 연구자는 더 쉽게 서로 데이터를 공유할 수 있습니다. 마지막으로, 정량적 값은 분석 중 이미지 전처리 지표로 사용할 수 있습니다.

_{그림 2. 형광 감지 프로세스는 광센서의 표면에 광자가 입사될 때 시작됩니다. 그 다음, 감지된 광자는 전자로 변환되고 증폭되어 전류로 출력됩니다. 이 전류는 증폭 회로를 통과한 후 아날로그에서 디지털로 변환됩니다. 그 다음, 디지털화된 신호가 산술 처리를 거쳐 각 픽셀에 대한 강도 값으로 전환되고 소프트웨어는 이미지에서 각 픽셀로 이러한 신호를 시각화합니다.}

높은 다이내믹 레인지

위의 항목들이 실현되어도 특정 시점에 감지 가능한 최대 광자 수(다이내믹 레인지라고 부름)가 작으면, 형광 강도가 높은 영역에서 강도 포화가 발생하고 정량성이 손실됩니다. 그리고 이미지 품질을 향상시키는 방법 중 하나는 강한 여기를 통해 방출 광자를 증가시켜 광자 잡음(센서에서 광자 감지 시 발생하는 확률적 잡음으로 산탄 잡음이라고도 함)을 억제하는 것입니다. 다이내믹 레인지가 높을 경우 밝기를 포화시키지 않고 고품질 이미지를 캡처할 수 있습니다. 예를 들면, 그림 3에서와 같이, 오른쪽에서 더 강한 여기에 의해 더 많은 형광이 감지될수록 이미지 품질이 좋아집니다. 그러나 궁극적으로 검출기 포화로 인해 많은 후처리 및 분석 단계가 위험에 처할 수 있습니다.

이미지 정량화를 위한 일관적인 감지기 게인

감지기 또는 회로의 조건을 변경하지 않고 높은 다이내믹 레인지를 유지하는 것이 이상적입니다. 예를 들어, 감지기 게인이 상위 범위를 확장하도록 변경되면, 결과적으로 이미지의 강도가 변화됩니다. 그러나 이 관계는 선형적이지 않기 때문에 획득된 이미지로부터 감지된 빛의 양을 역방향으로 추산하기가 어렵습니다. 보정을 위해 보정 곡선을 별도로 준비해야 합니다. 반면, 그림 3의 선 차트 플롯은 각 이미지에서 라인 A의 밝기 프로파일을 보여줍니다. 고정된 감지기 설정에서 이를 획득하면, 어느 이미지의 강도로나 각 픽셀에서 감지된 광자 수를 정량적으로 계산할 수 있습니다.

_{그림 3. 형광 강도와 이미지 품질의 관계. 신호 대 잡음비는 형광 강도/√형광 강도로 결정됩니다.}
 

3. LSM 이미징 시 기존 PMT 감지기에서 발생하는 문제

아래에서는 레이저 스캐닝 현미경 검사를 위해 PMT 감지기를 사용할 경우 발생하는 주요 문제를 논의합니다.

높은 감도와 높은 신호 대 잡음비(S/N)를 동시에 달성하는 것은 어렵습니다.

현재 일반적으로 GaAsP 광전 음극 타입 PMT[1]가 고감도 감지기로 사용됩니다. 이 PMT의 가시광 범위 QE는 40% 이상으로 개선되었습니다. 센서와 회로의 잡음 때문에 이 상대적 잡음이 이미지에 영향을 미치지 않도록 보통 높은 게인으로 신호를 증폭하여 이러한 PMT를 사용해 왔습니다. PMT는 또한 광수신 표면에서 광자를 전자로 변환합니다. 이 전자는 그 다음 확률론적 다단계 증폭 프로세스를 거쳐 전류 신호를 생성합니다(그림 4). 따라서 감지된 광자 수가 일정할지라도 확률론적 변동 때문에 매번 출력이 달라집니다. 이는 이미지의 신호 대 잡음비(S/N)를 낮출 수 있습니다. 특히 감지된 광자가 더 적은 고픽셀 고속 이미징의 경우 더 효과적으로 S/N을 낮출 수 있습니다.

_{그림 4. PMT의 입력-출력 특성 구성. 광자가 광전 음극에 입사되면 광전 음극에서 방출된 전자가 진공관에서 증폭됩니다. 2차 전자가 반복적으로 여러 다이노드 체인에서 증폭됨에 따라 하나의 광자를 감지할 때의 출력 펄스 신호가 불균일해지거나 불안정해집니다.}

감지된 광자의 낮은 강도 정량성

위에서 언급한 대로 PMT는 광전자 증폭 동안 확률적 변동이 발생합니다. 따라서, 입력/출력 정량성이 낮으며, 이는 특히 광자 감지 속도가 느릴수록 낮아집니다. 또한, 전극 사이에 적용되는 전압을 변경하여 게인을 조정할 수 있지만, 이에 상응하는 입력 및 출력 비율도 변합니다. 동일한 전압이 적용되어도, 개별적 차이 때문에 각 PMT마다 실제 게인이 크게 달라집니다. 그리고 대량의 광자를 증폭하기 위해 적용된 전압의 수준이 낮게 설정된 경우, 선형성이 악화됩니다.[1]

또한, 사용에 따라 감지된 광자가 축적됨에 따라 다음과 같이 피할 수 없는 현상 때문에 PMT의 감도가 악화됩니다.

• 광자가 광전 음극에 들어가면 외부 광전 효과 때문에 광전 음극에서 전자가 방출되어 진공관으로 들어갑니다. 전자가 충분히 보충되지 않으므로 광전 음극은 약화됩니다.
• 광전 음극에서 방출된 전자(광전자)와의 충돌로 인한 다이노드의 약화
• 광전자가 진공관의 잔여 가스 또는 불순물과 충돌하여 생성되는 이온과의 충돌로 인한 광전 음극 또는 다이노드의 약화
• 광전자와 다이노드의 충돌로 인해 다이노드에서 생성된 불순물로 인한 진공 감소

위와 같은 이유 때문에 PMT를 사용하는 LSM은 검출된 빛의 양과 이미지 강도 사이의 정량성을 달성하지 못합니다.

높은 다이내믹 레인지와 높은 신호 대 잡음비(S/N)를 동시에 달성하는 것은 어렵습니다.

센서 게인이 증가되면 잡음이 있어도 몇몇 광자의 약한 신호를 여전히 감지할 수 있어 높은 신호 대 잡음비가 달성됩니다. 그러나 PMT의 출력 전류 상한은 몇 μA밖에 되지 않습니다. 게인이 높으면 적은 수의 감지 광자가 있을지라도 출력이 쉽게 포화되어 다이내믹 레인지가 작아집니다(그림 5a). 반면, 게인이 낮으면, 강한 형광(많은 수의 광자)이 감지되어도 출력 신호가 포화되지 않고, 다이내믹 레인지가 높아집니다. 그렇지만, 몇 개의 광자에 불과한 약한 형광은 증폭되지 않고 잡음에 묻히게 되어 신호 대 잡음비(S/N)가 악화됩니다(그림 5b). 따라서, 물체의 밝기와 요구되는 이미지 품질 수준에 따라 감지기의 게인을 사용자가 수동으로 조정해야 합니다. 또한, 이러한 조정으로 인해 다이내믹 레인지와 S/N이 의도치 않게 변경된다는 단점이 있습니다.

_{그림 5. PMT의 게인을 조정할 때 신호 대 잡음비와 다이내믹 레인지의 균형을 맞춰야 함 (a) 높은 게인 - 하나의 광자를 감지할 때 출력 신호를 잡음보다 높게 증폭할 수 있지만 이럴 경우 다이내믹 레인지가 낮아짐 (b) 낮은 게인 - 몇 개의 광자를 감지할 때 출력 신호를 잡음과 구분할 수 없음. 반면, 다이내믹 레인지가 더 높고, 많은 수의 광자를 감지할 경우 포화되지 않음.}

복잡한 감지 설정

밝기 포화를 피하면서 만족스러운 이미지 품질을 얻기 위해 감지기 설정을 조정하는 일은 복잡하며, LSM에 숙련되지 않은 사용자는 이러한 조정 작업을 수행하기가 어렵습니다. 그림 6은 여러 감지기 게인 설정으로 달라진 여러 형광 강도를 나타내는 형광 비드를 예로 보여줍니다.

그림 6a는 높은 게인으로 획득된 여러 여기가 적용된 비드를 보여줍니다. 어두운 비드는 약한 여기를 적용해도 잡음과 거의 구분할 수 없지만(그림에서 가장 왼쪽에 있는 이미지), 밝은 비드는 여기광이 증가됨에 따라 포화됩니다(그림의 오른쪽에 있는 두 개의 밝은 비드 부분).

반면, 그림 6b는 낮은 게인으로 획득한 동일한 형광 비드 이미지를 보여줍니다. 약한 여기가 적용된 어두운 비드의 신호(다이어그램의 왼쪽에 있는 두 개)는 잡음에 묻힙니다. 최고 수준으로 설정된 경우에도 밝은 비드가 포화되지 않았다는 점에서(다이어그램에서 가장 오른쪽) 이는 높은 게인보다 더 낫지만, 어두운 비드의 신호 대 잡음비에 집중할 경우 그림 6a의 가장 오른쪽 이미지(높은 게인으로 캡처한 이미지)보다 더 높은 신호 대 잡음비를 달성하지 못했습니다.

세포 표본의 일반적인 형광 이미지는 영역별로 밝기가 상당히 다르며, 타임랩스 또는 Z 스택 이미지는 스택 전반에서 밝기의 차이가 훨씬 더 클 수 있습니다. 숙련된 사용자도 최적의 감지기 설정을 찾아내어 밝은 영역을 포화시키지 않고 어두운 영역에서 만족스러운 신호 대 잡음비를 달성하는 이미지를 획득하기가 어렵습니다. 많은 사용자가 감지기 게인, 여기광 강도, 노출 시간 등을 조정하면서 시행착오를 거칩니다. 이 때문에 현미경 검사자는 많은 실패 이미지를 만들게 될 수 있습니다.

포화를 유발하지 않는 감지기 설정 때문에 신호 대 잡음비가 불충분할 경우, 여러 프레임을 캡처하고 이를 평균화 또는 축적하여 무작위 잡음만 억제함으로써 신호 대 잡음비를 개선할 수 있습니다. 이 경우 많은 프레임을 캡처해야 하며, 이로 인해 실제 이미지 프레임 속도가 상당히 감소하게 됩니다.

위에서 설명했듯이, PMT를 사용하는 기존 LSM은 검출기 게인, 여기 빛 강도, 노출 시간뿐만 아니라 프레임 간 시간 평균화 회수와 같은 복잡한 이미징 매개변수를 조정해야 합니다.

_{그림 6. PMT의 게인을 조정하려면 신호 대 잡음비와 다이내믹 레인지 사이의 균형을 유지해야 하지만, 이 작업은 어려울 수 있습니다. 이 이미지들은 서로 다른 여기 레이저 설정으로 획득되었습니다(오른쪽 이미지가 더 높은 설정에서 획득됨). 이미지 아래의 플롯은 라인 A를 따라 강도 프로파일을 보여줍니다. 신호 대 잡음비는 S(프로파일 높이) 및 Ns(광자 잡음) 및 Nd(회로 잡음)의 비율입니다. 그림 6a는 높은 게인으로 획득된 샘플을 보여줍니다. 어두운 비드는 신호 대 잡음비(S/N)가 더 높지만, 더 밝은 비드는 포화됩니다. 그림 6b 는 낮은 게인으로 획득된 샘플을 보여줍니다. 어두운 비드는 신호 대 잡음비(S/N)가 더 낮지만, 더 밝은 비드는 포화되지 않습니다.}

감지 회로 문제

센서뿐만 아니라 감지 회로의 문제도 있습니다. 센서 신호와 증폭되는 회로에 잡음이 많기 때문에 아날로그-디지털 컨버터에 의해 샘플링된 원시 신호가 픽셀 데이터로 처리될 경우 신호 대 잡음비(S/N)가 매우 낮아집니다(그림 7a, 왼쪽). 일반적으로, 아날로그 감지 회로에서 저주파 통과 필터 또는 통합 장치로 평활화한 후 신호를 샘플링하면 신호 대 잡음비를 형광 강도의 실제 값과 동일하게 향상할 수 있습니다(그림 7a, 오른쪽). 그러나 공진 스캐너와 같이 스캔 속도가 빠를수록, 표본의 구조를 횡단하는 데 걸리는 시간이 짧아집니다. 그림 7b는 그림 7a에 제시된 동일한 구조에 대한 형광 이미지를 보여줍니다. 다만, 그림 7b는 그림 7a보다 두 배 더 빠른 속도로 스캔한 것입니다. 잡음 감소를 위한 저주파 통과 필터를 동일한 방식으로 적용하면, 높은 공간 주파수를 가진 미세 구조를 분해하는 시간 분해능이 불충분해지고, 결과적으로 얻은 이미지의 공간 분해능이 저하될 것입니다(그림 7b, 오른쪽).

저주파 통과 필터의 컷오프 주파수를 증가시키면 시간 분해능이 향상됩니다. 그러나 잡음 억제 효과가 저하되고 신호 대 잡음비가 악화됩니다. 저주파 통과 필터의 컷오프 주파수가 증가되어도 신호 대 잡음비가 감소하지 않도록 하려면, 하나의 픽셀 내에서 많은 샘플링을 수행(오버샘플링)하기 위해 픽셀 클럭의 몇 배에서 수십 배까지 AD 변환기의 샘플링 속도를 증가시켜야 합니다. 또한, 스캔 속도가 빨라지고 픽셀 수가 증가할 수록 한 픽셀의 체류 시간이 짧아집니다. 이러한 이유로 AD 변환기의 샘플링 속도를 빠르게 해야 합니다.

잡음 평활화의 경우, 또 다른 문제는 아날로그 회로가 시간 분해능을 희생하여 저주파 통과 필터와 같은 단순한 필터만을 사용할 수 있다는 것입니다. 고속으로 샘플링된 데이터에 고급 디지털 신호 처리 필터를 적용하여 시간 분해능을 희생하지 않고 잡음만을 분리하는 필터 방법이 바람직합니다.

_{그림 7. 잡음 감소가 이미지 품질과 공간 분해능에 주는 영향. 그림 7a는 표준 스캔 속도로 캡쳐되었으며, 잡음을 감소시켜 이미지 품질을 향상시켰습니다. Figure 7b는 7(a)에 사용된 속도보다 두 배 더 빠른 스캔 속도로 캡처되었으며, 신호 대역 하강으로 인해 공간 분해능이 저하된 것을 볼 수 있습니다.}

PMT로 인한 위의 LSM 이미징 문제는 새로운 반도체형 SiPM 센서를 고속 디지털 샘플링과 결합하는 Evident의 SilVIR 감지기를 사용하여 해결할 수 있습니다. 다음 섹션에서는 Evident의 첨단 기술로 위의 문제를 어떻게 해결했는지 설명합니다.
 

4. SilVIR 감지기 기술 소개

4-1. SiPM 기능

SilVIR 감지기의 핵심 요소인 SiPM 센서는 가이거 모드(Geiger-mode) 애벌런치 광다이오드(APD, single-photon counting avalanche photodiode(SPAD)) 수천 개로 구성된, 2차원 어레이로 구성된 반도체 센서입니다. 감지된 신호는 모든 APD의 합으로 출력됩니다[2](그림 8).

가이거 모드에서는 게인이 높아도 매우 안정적인 배가 프로세스에 의해 높은 신호 수준에서 하나의 광자 인시던스가 감지됩니다. 또한, 반도체 제조 프로세스를 통해 SiPM의 개별적 변화를 정밀하게 통제할 수 있습니다. 일관적인 대량 생산을 통해 SiPM 간 광자 감지 효율성(photodetection efficiency, PDE) 및 게인의 차이를 높은 수준으로 최소화할 수 있습니다. 또한, 다수의 광자가 동시에 입사해도, 각 APD 전류의 합이 SiPM에서 출력되므로, 출력 전류의 상한이 높고 이 덕분에 다이내믹 레인지가 넓어져 많은 입사 광자를 감지할 수 있습니다. 다시 말해, 하나의 광자 신호를 높은 게인으로 배가할 수 있으며, 감지 범위가 넓어집니다. 이를 통해 높은 신호 대 잡음비와 넓은 다이내믹 레인지를 동시에 달성할 수 있으므로 게인을 조정하여 이 둘 중 하나를 희생할 필요가 없습니다.

또한, 광다이오드와 같은 SiPM에 의한 광전 변환은 전자가 원자가 대역에서 도체로 여기되는 내부 광전 효과를 이용합니다. 그러므로, 여기될 때 전자가 빨리 보충됩니다. 그 결과, 많은 양의 입사광이 있어도 감도와 게인이 저하되지 않습니다.

_{그림 8. 실리콘 광전자 증배관(SiPM) 센서의 구조와 입력-출력 특성. 그림 8(a)는 SiPM이 다중 픽셀 APD로 구성되어 있음을 보여줍니다. 하나의 광자가 APD의 광자 수신 표면에 입사되면, 현재 신호가 내부 광전 변환 후 애벌런치(avalanche) 계층에서의 애벌런치 전자 증폭에 의해 출력됩니다. 그림 8(b)는 다수의 광자가 동시에 입사되면, 출력 신호는 APD 신호의 합이라는 것을 보여줍니다. 감지된 광자에 반응하여 생성된 APD의 출력 파형은 일정하고 안정적입니다.}

또한, SiPM 센서는 탁월한 감도가 특성입니다. 그림 1b는 SiPM 센서의 스펙트럼 감도를 보여줍니다. 광대역 실리콘 감지기(broadband silicon detector, BSD)와 적색 강화 실리콘 감지기(red-shifted silicon detector, RSD)라고 불리는 서로 다른 스펙트럼 감도를 가진 SiPM 센서 조합을 사용하여 가시광(400nm)에서 근적외선(900nm) 파장 범위까지 GaAsP-PMT 감지기보다 더 나은 감도를 달성할 수 있습니다. SiPM의 광자 감지 효율성(PDE)은 다음 공식으로 정의됩니다.

PDE = QE × FF × AP

QE: Quantum efficiency(양자 효율성)
FF: Aperture efficiency(fill factor)(조리개 효율성(충전율))
AP: Probability of Geiger mode(avalanche probability)(가이거 모드의 확률(애벌런치 확률))

FF는 APD 픽셀 간 데드존의 면적 대비 SiPM 광자 수신 표면의 APD 면적으로 결정됩니다. AP는 SiPM에 적용되는 전압에 따라 달라집니다. 전압이 높을수록 달성 가능한 PDE도 높아집니다. 반면, 적용된 전압을 높이면 센서의 잡음도 증가합니다. 예를 들면, Hamamatsu Photonics가 만든 S13360-3050 모델의 경우, 과전압(항복 전압을 초과하여 적용되는 전압)을 3V에서 7V로 증가시키면 PDE가 약 1.4배 증가될 수 있지만, 다크 카운트 잡음은 약 2배, 크로스토크 잡음은 2배 이상, 애프터 펄스 잡음은 3배 이상 증가됩니다[2]. 이렇게 증가된 잡음은 증가된 PDE의 장점을 상쇄하므로 결과적으로 신호 대 잡음비가 개선되지 않습니다. 또한, 잡음 증가는 SiPM의 주요 장점 중 하나인 광자 감지 정량성을 크게 저해합니다. 게다가, 게인 또한 2 이상의 계수로 증가되므로, 감지 다이내믹 범위가 작아집니다. 높은 PDE 또는 QE 값만 중시할 경우 발생할 수 있는 함정의 예는 의도하지 않은 단점이 발생할 수 있으므로 이러한 특성을 맹목적으로 좇지 않아야 함을 일깨워줍니다. 이러한 이유로, FV4000 컨포컬 현미경은 형광 검출을 위해 과전압이 최적화된 SiPM을 사용하여 잡음 수준과 감도 간의 균형을 유지하며 탁월한 다이내믹 레인지를 구현합니다.

SiPM의 다크 카운트 잡음이 PMT보다 높다는 사실은 단점으로 자주 언급됩니다. 이에 대한 대책으로 광자 수신 표면을 약 -20°C(-4°F)로 냉각하여 다크 카운트 잡음을 초당 몇 킬로카운트에서 수십 킬로카운트 사이로 감소시킵니다. 그러나, 이는 여전히 냉각된 PMT보다 더 큰 수치입니다. 하지만 다크 카운트 잡음이 초당 10킬로카운트인 SiPM을 2µs/픽셀의 체류 시간에서 512픽셀/라인으로 스캔하는 데 사용하면, 1광자에 상응하는 다크 카운트 잡음이 1라인당 약 10개 픽셀에서만 나타납니다. 이 정도 양은 LSM 이미지 품질에 거의 영향을 끼치지 않습니다.

SiPM을 LSM 감지기로 사용할 경우 발생하는 또 다른 단점은 출력 신호에 롱테일 붕괴가 남아 있을 수 있다는 것입니다(그림 8). 이는 고속 이미징에 문제를 일으키지만, Evident는 혁신적인 감지 회로 솔루션을 구현하여 이 문제를 성공적으로 해결했습니다. 이에 관해서는 다음 섹션에서 설명합니다.

4-2. 고속 샘플링 및 디지털 처리 기능

위에서 설명한 대로, 기존 시스템은 아날로그 회로 필터링을 사용하는 신호 평활화와 픽셀 해상도를 위한 최소의 필요 AD 샘플링 주파수(픽셀 기간의 약 1/2 수준인 샘플링 기간)를 결합하여 신호 대 잡음비와 시간 분해능의 균형을 유지했습니다. 그러나 이 해결책은 고속 공진 스캐너에 의한 높은 픽셀 수(짧은 픽셀 기간)에 대응하는 데 기술적 한계를 가졌습니다(그림 9a).

고속 AD 샘플링

Evident는 기존 샘플링 속도보다 12배 더 빠른 1GHz AD 샘플링 속도를 실현하고, 하나의 픽셀 기간 내에서 다량의 샘플링을 수행하는 오버샘플링 방법을 채택했습니다. SiPM 센서 출력의 다이내믹 레인지는 넓기 때문에 출력 신호의 범위도 PMT에 비해 매우 넓습니다. AD 샘플링 속도가 더 높을 뿐 아니라, 진폭 해결 정확도도 기존 장치보다 16배 더 높습니다(10비트에서 14비트). 이 고성능 장치는 SiPM 신호 처리 분야에 최적화되어 있습니다. 잡음 격리는 아날로그 회로 필터 대신 디지털 신호 처리 필터를 사용합니다. 이 필터는 더 높은 신호 대 잡음비를 달성하기 위해 신호 대역의 희생을 최소화하면서 효율적으로 잡음을 약화시킵니다. 따라서, 기존 방법으로 분리할 수 없었던 고주파수 구성 요소를 별도로 감지할 수 있으며, 공진 스캐너의 픽셀 수가 1k 이상인 경우에도 충분한 픽셀 해상도(시간 분해능)를 달성할 수 있습니다(그림 9b).

_{그림 9. 잡음 감소 능력 향상이 이미지 품질과 공간 분해능에 주는 영향. 그림 9(a)는 아날로그 회로 필터와 느린 속도의 샘플링을 사용하는 기존 방법을 보여줍니다. 스캔 속도가 빨라지면 신호 대역폭이 줄어들기 때문에 공간 분해능이 저하됩니다. 그림 9(b)는 공간 분해능을 유지하면서 고속 스캔을 수행하는 동안 고속 샘플링과 디지털 필터 지원 잡음 감소가 함께 사용된 것을 보여줍니다.}

필드 프로그래밍 가능 게이트 어레이에서의 실시간 역변환을 통해 신호 붕괴 제거

또한 Evident는 아무 제한 없이 필드 프로그래밍 가능 게이트 어레이(FPGA)에서 고급 신호 처리를 활용하여 SiPM 센서의 단점인 느린 신호 붕괴로 인한 대역폭 저하를 복원하는 기법을 개발했습니다. 붕괴 신호 제거 기법으로 강제 재설정 방법이 알려져 있습니다[3]. 그러나, Evident의 기법을 사용하면 기존 기법이 요구하는 복잡한 감지 회로 없이도 고속으로 출력 신호를 복원할 수 있습니다.

SiPM 센서는 광자 감지 시간과 감지된 광자 수를 정확하고 빠르게 출력할 수 있지만, 느리게 붕괴되는 출력 신호라는 한 가지 단점이 있습니다. 공진 스캐너를 사용하여 이미징을 수행할 때, 짧은 픽셀 체류 시간으로 인해 붕괴 신호가 주변 픽셀로 누출되며, 이러한 누출 때문에 픽셀 해상도와 시간 분해능이 저하됩니다(그림 10a).

SiPM을 사용할 경우 총 신호 출력은 각 APD의 신호 출력의 합이고, 각 APD의 광자 인시던스에 반응하여 생성된 출력 반응 펄스 파형은 매우 안정적이며 PMT에 비해 일정한 모양을 유지합니다. 입력에 대한 반응을 고유하게 정의할 수 있으면, 최종 출력을 입력에 대한 반응의 콘볼루션 합으로 얻을 수 있습니다. 그림 10b에서 광자 감지 시간과 수를 x(t)로, 센서 반응을 h(t)로 가정하면, 출력 y(t)는 다음과 같이 계산됩니다.

y(t)=(x*h)(t)=∑x(i)h(t-i)

붕괴 신호를 포함하여 SiPM 출력 신호 y(t)를 측정할 때, 센서 반응 h(t)를 정의할 수 있으면, 이 역변환을 실행하여 붕괴 신호를 포함하지 않은 광자 감지 이벤트 x(t)를 계산할 수 있습니다. 이러한 계산은 콘볼루션 필터[4]와 동일한 개념에 기초합니다. 콘볼루션 필터는 흔히 신호 파형의 테일을 없애기 위해 적용됩니다. 예를 들면, 신경과학 분야에서 칼슘 이온 변화의 스파크 신호를 정량적으로 분석하는 경우가 있습니다. FPGA는 장치 내 역변환 계산의 실시간 처리를 지원하는 고속 첨단 디지털 신호 프로세서(digital-signal processor, DSP)를 사용합니다. Evident는 그림 10c에서 볼 수 있듯이, 실시간으로 FPGA에서 역변환된 센서-신호의 출력 데이터를 확보하는 기법을 개발했습니다[5].

그림 10a에서와 같이 Evident는 이렇게 역변환된 데이터 시퀀스를 사용하여 픽셀 강도를 계산함으로써 붕괴 신호가 주변 픽셀로 누출되지 않도록 했습니다. 또한, 복원 필터는 붕괴 신호를 제거할 뿐만 아니라 원래 광자-감지 반응과 다른 혼합 잡음을 격리합니다. 이 때문에 신호의 신호 대 잡음비가 더욱 향상됩니다.

_{그림 10. SiPM의 붕괴 신호로 인한 대역폭 저하를 복원하는 기법의 개요. 그림 10(a)는 센서 붕괴 신호와 공간 분해능 저하를 보여줍니다. 10(b)는 SiPM 센서의 입력 및 출력 관계를 보여줍니다. 10(c)는 디콘볼루션에 의한 입력 신호 계산을 보여줍니다.}

그림 11에서 볼 수 있듯이, 역변환이 없다면, 특히 고속 및 고해상도 공진 스캔 도중 SiPM 신호 붕괴의 영향 때문에 이미지 픽셀 해상도가 저하됩니다. 반면, 역변환을 적용하면 광자 입력을 잃지 않고 시간 분해능을 복원할 수 있으므로, 특별 해상도 및/또는 감지된 광자 손실 없이 고해상도 공진 스캐너 이미지(1024픽셀/라인)를 획득할 수 있습니다.

_{그림 11. BPAE 세포(Actin(BODIPY FL)에서 역변환을 적용하거나 적용하지 않고 캡처한 샘플을 보여주는 예, 공진, 평균 64, ex. 488nm, Em. 500–540nm, 동일한 여기 출력, UPLSAPO40x2/NA 0.95, CA 1 AU, 1024 × 1024픽셀.}

하이 다이내믹 레인지 광자 계수

원시 SiPM 출력 신호는 신호 붕괴 전에 더 많은 광자를 감지하는 경우(그림 11의 파란색 선)와 같이 고주파수 광자-감지 이벤트가 발생할 때 축적되기가 더 쉽습니다. 따라서, SiPM의 하이 다이내믹 레인지를 활용하려면, AD 변환기의 변환 규모가 축적 효과를 포함하여 고주파수 광자 감지의 신호 진폭보다 커야 합니다. 반면, 역변환 프로세스를 정확하게 수행하려면 가장 작은 신호인 한 광자의 신호 진폭을 미세 분해능 피치로 검출해야 합니다. 따라서, 더 미세한 해상도와 더 큰 축적 효과를 가진 작은 진폭을 캡처하려면 해상도가 더 높은 AD 변환기가 필요합니다. 또한, 매우 높은 시간 분해능, 즉 빠른 샘플링 속도로 획득된 많은 디지털 데이터 시퀀스 없이 역변환은 불가능합니다. 일반적으로, 고속 장치를 위한 1GHz 샘플 속도를 가진 AD 변환기는 8비트 정도의 해상도를 갖고 있습니다. 그러나 우리는 1GHz 샘플 속도를 구현하는 하이엔드 AD 변환기, 14비트 해상도(16384 그라데이션), 하이엔드 FPGA를 사용하는 이러한 변환기에서 얻은 고속 디지털 데이터를 사용하여 이러한 역변환 프로세스를 달성했습니다.

이러한 역변환된 신호(그림 11의 주황색 선)가 복원되어 붕괴 신호를 제거함으로써 시간 분해능을 유지합니다. 축적된 신호를 평탄화함으로써 감지된 광자 수에 상응하는 펄스-출력 진폭(파장 피크 값)을 얻을 수 있습니다. 다시 말해, 하나의 광자가 감지되면, 동일한 진폭의 펄스가 출력됩니다. 이와 유사하게, 두 개의 광자가 동시에 감지되면, 진폭이 두 배 높은 펄스가 출력됩니다. 그 후 여러 광자들이 동시에 감지되면 한 광자의 진폭에 정수를 곱한 값에 해당하는 진폭으로 펄스가 출력됩니다. 따라서, N개의 광자가 특정 시간 간격 이내에 감지되면, 이러한 출력 펄스의 시간 적분은 한 광자의 감지 시점에서 펄스의 N배를 적분한 강도로 얻을 수 있습니다. 또한, 매우 짧은 시간 이내에 많은 수의 광자가 감지될 경우에도 이 관계가 적용됩니다.

결과적으로, 이 방법은 많은 수의 광자가 짧은 시간 동안 감지된 경우에도 광자를 별개로 감지할 수 있는 신호 대 잡음비로 형광을 정확하게 감지하도록 지원합니다. 실측한 수치를 제시하자면, 이 신호 대 잡음비로는 포화 없이 초당 최대 1기가폰톤을 감지할 수 있습니다. 기존의 단광자 계수(마비 또는 비마비)[1]는 저주파수 광자 감지 속도에서만 적용할 수 있지만, 현재의 기법은 HDR 광자 계수를 달성합니다. HDR 광자 계수는 고속으로 매우 밝은 샘플을 이미징하는 경우에도 단광자 계수와 신호 대 잡음비가 유사합니다(그림 12).

_{그림 12. 여기 강도 및 출력 신호 간의 관계. 여기 출력을 증가시키면 특정 시점당 더 많은 수의 광자를 감지할 수 있습니다. 기존 광자 계수 방법을 사용하면 낮은 감지 광자 속도에서 출력 신호가 포화됩니다. SilVIR 감지기가 제공하는 HDR 광자 계수를 사용하면 고주파수 입사 광자 속도에서도 포화가 발생하지 않습니다. 단광자 계수의 그래프 곡선은 1.2nsec 펄스 페어 분해능으로 계산되었습니다.}

4-3. SilVIR 감지기의 장점

SilVIR 감지기 시스템은 SiPM 센서와 고속 샘플링된 디지털 처리의 조합입니다. 이전 섹션에서는 이상적인 LSM 형광 감지와 기존 LSM의 상태를 설명했고, 기존 LSM이 이상과 어떻게 괴리되어 있는지 알아보았습니다. 그러나, Evident는 SilVIR 감지기를 사용하여 이상에 가까운 LSM 형광 감지를 실현했습니다.

높은 감도 및 신호 대 잡음비

이상적인 감지 시스템은 광자 감지 효율성(PDE)이 높고 센서 또는 전기 회로 잡음이 없어야 합니다.

SilVIR 감지기는 두 가지 유형의 SiPM 센서를 사용하여 다이내믹 레인지와 신호 대 잡음비 중 어느 것도 포기하지 않고 가시 범위 및 NIR 모두에서 높은 PDE를 달성합니다. 또한 전기 회로 잡음이 광자 하나 수준 이하로 억제되고 암전류가 무시할 만한 수준으로 적기 때문에 SilVIR 감지기에서는 광자 산탄 잡음이 지배적입니다. 따라서 감지된 광자 수로부터 다음 공식에 따라 대략적인 신호 대 잡음비를 계산할 수 있습니다.

S/N ratio(신호 대 잡음비) = N/√N = √N

N: 감지된 광자 수

신호 대 잡음비를 더 쉽게 정량화할 수 있으므로, 이미지 공유 및 이에 대한 논의를 위해 그리고 일상적인 이미징 실험에서 이미지 품질을 재현하기 위해 감지된 광자 수를 유용한 지표로 사용할 수 있습니다.

감지된 형광 강도의 정량성

이상적인 감지기는 정량적 척도에서 감지된 형광의 양과 강도를 연관지을 수 있어야 합니다. 그러나 기존 기술을 사용할 경우 이 관계가 불분명하고 불명확했습니다. SilVIR 감지기는 분명한 정량적 척도, 즉 광자 수를 사용하여 감지된 형광의 양을 정량화할 수 있습니다.

넓은 다이내믹 레인지

이상적인 감지기는 광자 한 개부터 수천 개까지 감지할 수 있을 만큼 넓은 다이내믹 레인지를 갖춰야 합니다. 그러나 기존 기술을 사용할 경우, 게인이 높으면 이 범위가 좁아지고 게인이 낮으면 이 범위가 넓어집니다. 따라서 신호와 잡음 중 하나를 희생해야 합니다. SilVIR 감지기는 게인이 높으므로 단일 광자도 감지할 수 있으며, 다이내믹 레인지가 넓으므로 짧은 시간 동안 수천 개의 광자를 감지할 수 있습니다.

단순한 감지 설정(고정된 게인)

감지기는 설정 조정이 복잡하면 안 됩니다. 그러나 기존 기술을 사용할 경우 사용자는 목표 형광의 밝기에 따라 고전압(high volatage, HV)을 지속적으로 조정해야 합니다. 반면, SilVIR 감지기를 사용하면, 스캔 속도, 픽셀 크기, 프레임 통합(또는 평균화) 수만 조정하면 됩니다.

그림 13에서와 같이 이미지의 강도 히스토그램은 SilVIR 감지기가 신호 대 잡음비가 높을 때에도 형광 신호를 개별적으로, 그리고 정량적으로 감지할 수 있음을 보여줍니다. 그림 13에서 강도는 빗 모양의 피크로 표현되었고, 대부분의 픽셀의 강도는 이러한 피크와 일치하는 강도 값에 주로 분포되어 있습니다. 각 피크는 이전 섹션에서 설명한 대로 펄스 신호의 피크 값으로부터 파악한 감지된 광자 수에 상응합니다. 예를 들면, 특정 픽셀에서 감지된 펄스 신호의 피크 값이 단지 1광자일 경우, 피크의 강도는 1광자에 상응하고, 특정 픽셀에서 감지된 펄스의 피크 값이 2광자인 경우, 피크의 강도는 2광자에 상응합니다. 마찬가지로, 감지된 광자 수가 증가해도 강도 값은 감지된 광자의 피크 위치로 변환됩니다. 이러한 프로세스는 자연적으로 소량의 잡음과 오류를 포함하기 때문에 많은 수의 광자가 감지될 경우 이러한 오류가 축적되고 높은 강도에서는 빗 모양의 피크를 나타내기가 어렵습니다. 그러나 이러한 잡음과 오류가 1광자의 강도보다 작은 수준으로 억제되므로, 이 히스토그램은 별개로 감지된 광자의 빗 모양 피크를 보여줄 수 있습니다. 1광자의 감지 강도에서 표준 편차가 약 1/3인 잡음을 포함한다고 가정하고 강도 분포를 시뮬레이션한 경우, 3~4광자보다 높은 피크를 나타낼 수 없습니다.

따라서 빛의 가장 작은 양자 단위인 1광자는 신호 대 잡음비가 충분할 때 잡음으로부터 구분하여 감지할 수 있습니다. 이는 이미지의 강도가 각 픽셀에서 감지된 광자 수에 상응하는 강도로만 구성되며, 오염된 잡음의 영향은 무시할 수 있거나 인식되지 않을 수 있음을 의미합니다. 다시 말해, SilVIR 감지기는 기존 광자 계수 방법을 사용하여 획득한 이미지에 상응하는 높은 신호 대 잡음비에서 이미지를 획득할 수 있습니다. 또한, 기존 광자 계수 방법은 더 긴 노출에서 낮은 수준의 형광을 감지할 때에만 효과적인 반면, SilVIR 감지기는 고속으로 고강도 형광을 이미징할 때에도 높은 신호 대 잡음비에서 감지할 수 있습니다. 이러한 기능 때문에 SilVIR를 정밀 형광 이미징을 위한 획기적인 감지기라고 할 수 있습니다.

FV4000 레이저 컨포컬 현미경의 경우, 그림 13의 가로 축에서 강도는 검출된 광자 수로 변환될 수 있으며, 이미지에서 강도 값에 대한 대안으로 표시될 수 있습니다. 광자 수는 빗 모양 피크 사이의 너비에서 변환할 수 있습니다. 피크 사이의 간격이 균등하기 때문입니다. 구체적으로 말하자면, 기존 광자 계수에서 1광자는 1카운트와 동일하지만, SilVIR 감지기는 1광자를 감지할 때 32카운트를 출력하도록 설계되었습니다. Evident의 방법을 사용하면 감지된 광자 수가 적을 때에도 획득된 이미지에 어느 정도의 그라데이션이 생길 수 있습니다. 따라서, 광자 수가 낮은 이미지를 축적 또는 평균화함으로써, 광자 수 정보가 잡음 또는 오류에 묻히지 않도록 하면서 신호 대 잡음비를 향상할 수 있습니다.

_{그림 13. FV4000 SilVIR로 획득한 형광 이미지와 픽셀 강도 히스토그램. 히스토그램은 광자를 개별적으로 감지할 때 생성되는 빗 모양 주파수 분포를 보여줍니다.}
 

5. SilVIR 감지기 이미지 예시

이 섹션에서는 SilVIR 감지기를 사용하여 캡처한 LSM 이미지를 제시합니다.

GaAsP-PMT를 사용하여 캡처한 이미지와 비교

그림 14는 SilVIR 및 GaAsP-PMT 감지기로 캡처한 녹색 형광 이미지를 보여줍니다. 일반적인 형광 강도를 달성하기 위해 샘플을 동일한 레이저 출력으로 여기했습니다. 강도가 상대적으로 강한 경우(약 128광자), 두 이미지 모두 비슷한 이미지 품질을 보이지만, SilVIR 감지기는 직접적으로 광자 수를 표현합니다.

_{그림 14. SilVIR 및 GaAsP-PMT 감지기 모두 동등한 신호 대 잡음 비로 밝은 샘플 이미지를 획득할 수 있습니다. 그림 14(a)는 SilVIR 감지기로 획득했으며, 14(b)는 550V에서 PMT로 획득했습니다. 동일한 샘플을 동일한 레이저 출력으로 여기했습니다. 최대 형광 강도는 약 128광자/2µs입니다.}

_{스캐너: 검류계 스캐너, 2µs/픽셀
여기: 488nm 레이저
방출: 500~540nm
BPAE 세포의 액틴 필라멘트(BODIPY FL)}

그러나 형광이 약한 경우에는 다릅니다. 그림 15는 두 개의 감지기를 사용하여 캡처한 약한 형광(약 12광자)을 가진 동일한 샘플을 보여줍니다. SilVIR 감지기를 사용하여 캡처한 이미지가 기존의 GaAsP-PMT를 사용하여 캡처한 이미지보다 잡음이 적은 것을 볼 수 있습니다. 또한 SilVIR 이미지의 강도 히스토그램은 빗과 같은 모양입니다. 이는 광자 수가 각 픽셀에서 정확하게 감지되었음을 나타냅니다. 반면, GaAsP-PMT 이미지의 강도 히스토그램은 이미지 강도가 무작위임을 보여줍니다. 이 경우 광자 정량화가 이루어지지 않습니다. 그리고 GaAsP-PMT의 경우 감지 대상 형광의 강도에 따라 고전압을 조정해야 하지만, SilVIR 감지기는 그렇지 않습니다.

_{그림 15. 이 그림은 700V에서 SilVIR 감지기(15a) 및 GaAsP PMT(15b)로 캡처한 매우 어두운 형광을 보여줍니다. 동일한 샘플을 동일한 레이저 출력으로 여기했습니다. 최대 형광 강도는 약 12광자/2µs입니다. SilVIR 감지기로 캡처한 이미지의 강도 히스토그램은 빗과 같은 구조를 보이며, 이는 광자 수가 정확하게 감지되었음을 의미합니다. PMT로 획득한 이미지의 배경에서는 잡음이 더 많이 관찰됩니다.}

_{스캐너: 검류계 스캐너, 2µs/픽셀
여기: 488nm 레이저
방출: 500~540nm
PtK2 세포의 마이크로튜블(Alexa Fluor 488)}

SilVIR 감지기를 사용하는 공진 스캐너의 높은 신호 대 잡음비 이미지

SilVIR 감지기는 저강도 형광 이미징에 매우 적합합니다. 특히, 공진 스캐너를 사용하여 이미지를 획득하는 경우 매우 짧은 픽셀 체류 시간으로 인해 감지된 광자 수가 매우 적으므로 높은 신호 대 잡음비로 이미지를 획득하기 어렵습니다. SilVIR 감지기는 이 문제를 극복합니다. 그림 16은 1024 × 1024픽셀에서 공진 스캐너로 캡처한 이미지입니다. 다른 평균화 수를 가진 이미지가 나열되어 있습니다. 감지된 광자 수가 여러 광자일지라도 우수한 이미지 품질의 공진 스캐너 이미지를 얻을 수 있으며, 적은 수의 평균화(또는 누적)로도 공진 스캐너 이미지를 처리하여 검류계 스캐너 이미지와 동등한 품질이 되도록 할 수 있습니다. 또한 이러한 장점은 획득 효율성을 향상합니다.

_{그림 16. SilVIR 감지기 및 1K 공진 스캐너를 사용하여 획득한 이미지. 그림 16(a)는 130msec/프레임에서 평균화가 없음을 보여주고, 16(b)는 262msec/프레임에서 2회 평균화를 보여주며, 16(c)는 522msec/프레임에서 4회 평균화를 보여줍니다. SilVIR 감지기는 공진 스캐너를 사용하면 높은 신호 대 잡음비를 달성할 수 있으므로, 적은 평균화로도 고품질 이미지를 얻기에 충분합니다. 이러한 장점은 획득 효율성을 향상시킵니다.}

_{공진 스캐너: 1024 × 1024픽셀 단방향, 픽셀 체류 시간: 0.033µs
최대 형광 강도: 약 20광자.}

SilVIR 감지기를 사용하여 스티칭된 이미지를 효율적으로 획득

넓은 영역을 대상으로 고해상도 이미지를 얻기 위해 이미지 스티칭을 자주 사용합니다. 검류계 스캐너를 사용하면 이 프로세스는 느리게 진행되지만, 공진 스캐너와 함께 SilVIR 감지기를 사용하면 이 프로세스의 효율성을 높일 수 있습니다. 그림 17에서는 4채널 1K × 1K 픽셀 이미지가 5 x 5 모자이크 필드에서 8개의 Z 슬라이스로 획득되었습니다. 검류계 스캐너를 사용한 경우 이미지 캡처에 30분 넘게 소요되었지만, 공진 스캐너를 사용한 경우 6분 미만이 소요되었습니다.

_{그림 17. SilVIR 감지기를 사용한 효율적인 이미지 획득. 공진 스캐너를 사용하여 스티칭된 Z 슬라이스 이미지의 최대 강도 투사를 수행했습니다. SilVIR 감지기의 높은 신호 대 잡음비 덕분에 많은 수의 이미지를 효율적으로 획득할 수 있습니다.}

SilVIR 감지기를 사용하여 하이 다이내믹 레인지 이미지 획득

기존의 PMT 이미징에서는 다이내믹 레인지가 제한됩니다. 샘플에 어두운 물체와 밝은 물체가 섞여 있는 경우, 이 중 하나를 우선시해야 합니다. 예를 들면, 그림 18에서는 뉴런의 이미지를 획득할 때 약한 형광의 신경 섬유 구조에 대한 선명한 이미지를 획득하기 위해 세포체의 강도 포화가 불가피했습니다. SilVIR 감지기는 16비트 다이내믹 레인지 덕분에 포화 없이 밝은 영역과 어두운 영역을 모두 획득할 수 있습니다.

_{그림 18. SilVIR 감지기를 사용한 하이 다이내믹 레인지 이미징. 그림 18(a)는 밝은 세포체가 쉽게 포화되는 기존의 이미지를 보여주며, 18(b)는 세포체와 신경 섬유 모두 감지 범위 내에 있는 SilVIR 감지기를 사용하여 캡처한 이미지를 보여줍니다. 감마 디스플레이를 조정하여 어두운 신경 섬유를 개선했습니다.}

SilVIR 감지기를 사용한 다색 이미징

가시광부터 근적외선까지 SilVIR 감지기의 높은 감도와 신호 대 잡음비를 활용하면, 크로스토크 효과를 방지하면서 6색 동시 이미징이 가능합니다(그림 16). 730nm으로 여기된 형광 염료는 GaAsP-PMT 감지기로 거의 이미지화할 수 없지만, SilVIR 감지기는 높은 신호 대 잡음비 이미지를 획득할 수 있습니다. FV4000 컨포컬 현미경은 최대 6채널 검출기를 장착할 수 있어 400~900nm의 나노미터 수준으로 정밀한 스펙트럼 해상도로 6가지 색상을 사용한 동시 이미징이 가능합니다.

_{그림 19. SilVIR 감지기와 TruSpectral 기술을 사용하여 캡처한 6색 동시 이미지. 가시광선부터 근적외선까지 다색 동시 이미징이 가능합니다.}
 

6. 결론

기존 감지기와 비교할 때 SilVIR 감지기는 다음과 같은 많은 장점을 제공합니다.

• 가시광선부터 근적외선까지의 파장 범위에서 높은 감도와 높은 신호 대 잡음비로 다색 이미징 수행
• 높은 광자 분해능(고속 및 하이 다이내믹 레인지 광자 계수)
• 감도 저하 없이 이미지 밝기 정량화를 통해 높은 실험 재현성 달성
• PMT처럼 게인을 조정하지 않아도 되므로 간편하게 작동 가능

이러한 장점 덕분에 광독성을 낮추면서 더 쉽게 높은 신호 대 잡음비로 고속 및 고해상도 이미지를 얻을 수 있습니다. 또한, 광자 수로 이미지 밝기를 정량화할 수 있으므로, 이미징 조건을 공유하고 재현하는 것이 더 쉬워집니다.

그리고, SiPM 센서는 향후 기술 발전 잠재력이 큽니다. 예를 들면, 출시 예정인 단광자 애벌런치 다이오드(SPAD) 어레이 센서와 가드 링 공유 기법[6]을 위해 개발 중인 마이크로렌즈 어레이를 성공적으로 배포할 수 있으면, PDE를 결정하는 매개변수 중 하나인 FF를 크게 향상할 수 있습니다. PDE를 향상할 수 있으면, 신호 대 잡음비, 다이내믹 레인지, 속도, 픽셀 수 간의 복잡한 관계에서 균형을 맞추기가 더 쉬워질 것입니다.

SilVIR 감지기는 기존 감지기의 문제점을 잘 극복했고 앞으로도 급속도로 발전을 거듭할 가능성이 있으므로, Evident는 이 감지기가 차세대 레이저 스캐닝 현미경의 표준이 될 수 있다고 생각합니다.
 

7. 참고 문헌

1. Hamamatsu Photonics “Photomultiplier Tubes: Basics and Applications 4th Edition” (Hamamatsu Photonics, 2017).
2. Hamamatsu Photonics “MPPC®” Cat. No. KAPD9005E04 (Hamamatsu Photonics, 2022).
3. J. Zheng, et al. “Dynamic-quenching of a single-photon avalanche photodetector using an adaptive resistive switch” Nat. Communications 13, Article number 1517 (2022).
4. J. Friedrich, P. Zhou, L. Paninski “Fast online deconvolution of calcium imaging data” PLoS Comput. Biol. 13(3) : e1005423 (2017).
5. Evident corporation, US Patent No. US11237047B2
6. K. Morimoto, E. Charbon “High fill-factor miniaturized SPAD arrays with a guard-ring-sharing technique” Opt. Express 28(9/27), 13068–13080 (2020).
    

8. 기술 용어 설명

외부 광전 효과: 금속 또는 반도체가 빛에 노출되면 금속 또는 반도체 안의 전자가 빛 에너지 때문에 외부(진공 공간)로 이동합니다.
내부 광전 효과: 반도체 또는 절연체에 빛이 방사되면 금속 내부에서 전자의 전도가 증가하는 현상을 의미하며, 이러한 현상으로 인해 전기적 전도율이 증가됩니다.
가이거 모드: 가이거(Geiger) 방전을 유발하는 인가 전압에 의해 애벌런치 광다이오드(avalanche photo diode, APD)가 작동하는 상태입니다.
항복 전압: 특정 수준 이상의 전압이 APD에 적용되면, 빛의 양에 상관없이 빛의 입사에 의해 광수신 요소에 내재한 특정 수준의 신호 출력이 생성됩니다(가이거 방전). 항복 전압은 이를 유발하는 최소 인가 전압입니다.
다크 카운트 잡음: 빛이 입사되지 않은 경우의 잡음입니다.
크로스토크 잡음: 주변 SiPM 픽셀에서 누출된 광전자에 의해 생성된 펄스 잡음입니다.
애프터 펄스 잡음: 원래 광자 검출 펄스에 반응하여 지연된 펄스 잡음입니다.
마비 모델 광자 카운트 검출: 광자 검출 펄스가 계속적으로 중첩되어 하나의 펄스를 분리할 수 없을 때의 단일 광자 카운트 검출입니다. 예: PMT를 사용한 광자 계수
비마비 모델 광자 카운트 검출: 광자 검출 펄스가 중첩되지만 신호가 펄스 페어 분해능 간격을 두고 출력되는 경우의 단일 광자 카운트 검출입니다. 이는 SiPM을 검출기로 사용하는 경우와 같습니다.
펄스 페어 분해능: 단일 광자 카운트 검출에서 광자 검출 펄스가 분리될 수 있는 최소 시간 간격입니다.
 

저자

Hirokazu Kubo
첨단 기술 부문, R&D, Evident Corporation